Первоначально реакцию гибридизации между меченым РНК-зондом и небольшим количеством комплементарных последовательностей из нескольких микрограмм суммарной геномной ДНК проводили с молярным избытком РНК – Сейчас, когда за счет амплификации ДНК в ПЦР удается получать большие количества специфических фрагментов ДНК, нет необходимости использовать избыток зонда. В описываемых ниже экспериментах используется по существу избыток тестируемой ДНК – Эта модификация позволяет увеличить отношение сигнала к фону, так как в этом случае уже не приходится удалять остатки длинного зонда с помощью РНКазной обработки.

При постановке эксперимента полезно иметь следующие контроли:

контроль 1: неспецифическая гибридизация зонда с тРНК-носителем;

контроль 2: положительный контроль на дикий тип – реассоциация зонда с клонированным фрагментом ДНК дикого типа;

контроль 3: зонд реассоциируют с известным мутантным фрагментом геномной ДНК, клонированным или полученным в ПЦР. Это дает возможность оценить эффективность расщепления неспарен, ных участков.

1. В стерильной микроцентрифужной пробирке смешайте следующие компоненты:

1 мкл амплифицированной в ПЦР геномной ДНК в концентрации примерно 100 мкг/мл или 1 мкл рестрицированной клонированной ДНК,

1 мкл меченого РНК-зонда, 30 мкл буфера для гибридизации.

2. Прогрейте смесь 10 мин при 95–100°С на кипящей водяной бане.

3. Воспользуйтесь микроцентрифугой, чтобы собрать конденсат на дне пробирки.

4. Инкубируйте смесь 60 мин при 40–45°С, чтобы произошла реассоциация между зондом и комплементарными ему последовательностями в тестируемом фрагменте геномной ДНК.

Примечание: по оригинальной методике гибридизацию проводят в течение 10–12 ч. Считается, что за это время реакция реассоциации между фрагментами геномной ДНК и РНК-зондом достигает насыщения. В клонированных и амплифицированных в ПЦР фрагментах геномной ДНК доля последовательностей-мишеней намного больше, поэтому время гибридизации можно значительно уменьшить. Сокращение сроков инкубации облегчает проведение эксперимента и уменьшает деградацию зонда. 5. Добавьте 350 мкл смеси РНКазы с РНКазным буфером. Как следует перемешайте встряхиванием. Эта смесь представляет собой буфер для РНКазной реакции с разведенной в нем до концентрации 40 мкг/мл прокипяченной РНКазой А и тРНК-носителем в концентрации 20 мкг/мл. Раствор можно приготовить за несколько часов до использования и хранить во льду. На 5 мл смеси надо 5 мл буфера для РНКазной реакции, 100 мкл исходного раствора прокипяченной РНКазы А, 20 мкл тРНК. Примечание: в большинстве наших опытов по РНКазному расщеплению концентрация РНКазы А была 40 мкг/мл. Однако, используя фермент из другой партии, мы обнаружили, что эта концентрация слишком велика – фермент в таком количестве разрушал гибриды РНК – ДНК – Положительных результатов удалось достичь, снизив его концентрацию до 4 мкг/мл. Поэтому мы рекомендуем каждую новую партию РНКазы перед использованием калибровать в пределе концентраций от 2 до 40 мкг/мл. Для калибровки желательно использовать как мутантный контрольный образец, так и контрольный образец дикого типа. В оптимальной концентрации РНКаза А эффективно расщепляет неспаренные участки в мутантном образце и дает фоновый сигнал в контроле дикого типа.

6. Инкубируйте 60 мин при 25°С.

Примечание: по оригинальной методике инкубацию проводили в течение 30 мин. За это время РНКаза А расщепляет многие неспаренные участки лишь частично, что приводит к появлению радиоактивных сигналов в участках геля, соответствующих фрагментам дикого типа. При более длительной обработке удается расщепить эти уже частично расщепленные РНКазой сайты полностью. Легче всего интерпретировать результаты РНКазной обработки, отбирая в процессе реакции аликвоты после 30, 60 и 90 мин инкубации. В ряде случаев полуторачасовая обработка бывает чрезмерной и приводит помимо прочего к деградации концевых областей фрагментов РНК. Поэтому если кинетика реакции не исследована, то оптимальным временем обработки следует считать примерно 60 мин.

7. Остановите РНКазную реакцию добавлением 10 мкл ДСН и 10 мкл протеиназы К. Инкубируйте 30 мин при 37°С.

8. Добавьте 10 мкг тРНК-носителя.

9. Экстрагируйте реакционную смесь один раз фенолом и один раз 2 FC. После первой экстракции осторожно отберите только 300 мкл верхнего водного слоя автоматической пипеткой с пластиковым наконечником и перенесите в другую пробирку. Делается это, чтобы не допустить попадания РНКазы из интерфазы между водным слоем и фенолом.

10. Осадите нуклеиновые кислоты этанолом. Промойте осадок 70%-ным этанолом и высушите.

Это интересно:

Класс первичные кольчецы (archiannelida)
Архианнелиды – наиболее примитивный класс кольчатых червей. Кольчатость их тела имеет первичный и примитивный характер. Первые признаки кольчатости возникают в поверхностных слоях тела. Процесс возникновения кольчатости исторически, видим ...

Сенсор для определения усваиваемых сахаров
При культивации микроорганизмов на патоке сахарного тростника, содержащей различные сахара, для контроля процесса брожения важно определение суммарного содержания усваиваемых Сахаров в среде. Так, при высокой концентрации сахара наблюдает ...

Роль животных в осуществлении биогеохимического круговорота вещ-в и трансформация энергии в биосфере
На Земле 2 кругов в-в: геологич (больш.) и биологич. (малый). Биогенн кругов представл 2 непрерывн., взаимосвяз., но противоположн. пр-ми: образ орг. соед. из неорг. в-в автотрофами с исп. солн. энерг, разруш. орг. в-в гетеротрофами до пр ...