Получение протеолитических фрагментов для анализа структуры и функции антител

Растительная протеаза папаин расщепляет молекулу IgG в шарнирной области между Cyl - и Су2-доменами на два идентичных антигенсвязывающих фрагмента Fab и один способный кристаллизоваться фрагмент, Fc. Изучение этих фрагментов существенно помогло установлению структуры и функций антител, поскольку дало возможность отделить область Fab, взаимодействующую с антигеном, от области Fc, ответственной за эффекторные функции, например за фиксацию комплемента, связывание с моноцитами или проникновение через плаценту.

При продолжительном папаиновом гидролизе от Fc-фрагмента отщепляется фрагмент Fc', состоящий из двух неполных СуЗ-доменов. Другой фермент, часто применяемый в структурно-функциональных исследованиях, — пепсин. Он расщепляет молекулу IgG на два крупных фрагмента — F2, включающий в себя целиком обе Fab-части, соединенные в шарнирных областях тяжелых цепей, и pFc', который соответствует двум СуЗ-доменам этой молекулы.

Молекулу IgG расщепляют и многие другие ферменты. Так, кратковременное воздействие трипсином на обработанные кислотой Fc-фрагменты позволяет выделить Су2-домен для последующего структурно-функционального сопоставления его с другими субфрагментами молекулы IgG, в частности с pFc'.

Связывание антителами разнообразных антигенов обеспечивают гипервариабельные последовательности антигенраспознающих центров.

Аминокислотная последовательность некоторых коротких участков вариабельной области тяжелых и легких цепей чрезвычайно изменчива. В легких цепях эти сегменты, названные гипервариабельными, находятся вблизи 30, 50 и 95 позиций. Их называют также участками, определяющими комплементарность, поскольку именно они образуют антигенсвязывающие центры молекулы антитела. Последовательности между гипервариабельными сегментами названы каркасными. В V-области каждой легкой и тяжелой цепи имеется по три CDR и по четыре FR.

Вариабельные области легких и тяжелых цепей пространственно свернуты так, что гипервариабельные участки находятся близко друг к другу и образуют на поверхности молекулы структуру, связывающую антиген. Такие сегменты располагаются чаше всего на изгибах пептидной цепи.

В структуре антител идентифицировано много участков, отвечающих за эффекторные функции.

Если локализация антигенсвязывающих центров была установлена очень быстро, то последовательности, ответственные за большинство эффекторных функций, долгое время не удавалось точно локализовать. Некоторые предварительные данные были получены в опытах по ингибированию функциональной активности антител их субфрагментами, образующимися при ферментативном расщеплении, однако дело продвигалось медленно, пока не стало возможным применение метода сайт-направленного мутагенеза, который позволяет вызывать избирательно замену различных аминокислотных остатков в известной пептидной последовательности и таким образом определять значение различных остатков для осуществления функции.

Прежде всего, этот метод был использован для изучения механизма активации комплемента антителами IgG. К тому времени уже было известно, что Clq взаимодействует с Су2-доменом IgG. С помощью сайт-направленного мутагенеза удалось выявить участок связывания Clq — боковые цепи трех аминокислотных остатков в Су2-домене, Glu-318, Lys-320 и Lys-322. Эта последовательность, по-видимому, типична для участков взаимодействия молекул IgG с Clq.

Это интересно:

Получение и использование вакцины и сыворотки. Определение вакцины
Вакцины ( Vaccines )- препараты, предназначенные для создания активного иммунитета в организме привитых людей или животных. Основным действующим началом каждой вакцины является иммуноген, т. е. корпускулярная или растворенная субстанция, ...

Получение персистентно инфицированных клеточных культур
Персистентной инфекции культур клеток при полном отсутствии ЦПД или минимальном его проявлении можно добиться несколькими способами. Одним из них является пассирование вируса с высокой множественностью инфекции и пересев выживающих клеток ...

Очистка РСВ методом изопикнического центрифугирования
Данный метод требует более длительного центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы или метризамида. Растворы метризамида обладают более низкой вязкостью и осмотическим давлением, чем растворы сахарозы, и поэтому их использование д ...