Методы исследования. Метод определения активности катепсина D

Материалы » Антиоксидантная система при внутриутробной гипоксии плода » Методы исследования. Метод определения активности катепсина D

Для определения активности катепсина D использовали 7,5%-ый гомогенат ткани на натрий-ацетатном буфере (рН 3,3). Препарат фермента (20 мкл) смешивали с 60 мкл 100 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 3,3) и преинкубировали 8 мин при температуре 37°С. Начинали реакцию прибавлением в опытные пробы 20 мкл 8% раствора гемоглобина, полученного из бычьей крови. Реакцию останавливали через 40 мин прибавлением 100 мкл 5% раствора трихлоруксусной кислоты. В контрольные пробы добавляли 20 мкл 8% раствора гемоглобина. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. После центрифугирования отбирали 100 мкл надосадочной жидкости и определяли количество образовавшегося тирозина методом Лоури. Пробы колориметрировали на КФК-2 при λ=750 нм. Активность фермента определяли как разность в оптической плотности между опытными и контрольными пробами. Активность фермента выражали в нмоль тир, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Количество белка в пробах определяли методом Лоури.


Это интересно:

Ламинарное и турбулентное движение
В зависимости от относительной роли флуктуационного и упорядоченного движений, а также от числа макроскопических степеней свободы, можно выделить три группы движений. Это, во-первых, хаотическое тепловое движение. В этом случае усредненны ...

Взаимосвязь человеческого мира с окружающей его средой.
Окружающая среда - это все, что окружает человека и прямо или косвенно влияет на его состояние и функционирование (развитие, рост, выживаемость и др.) Окружающая среда включает в себя природную среду, возникшую на Земле вне зависимости от ...

Происхождение и эволюция млекопитающих
Предками млекопитающих были примитивные палеозойские рептилии, еще не успевшие приобрести узкую специализацию, столь характерную для большинства последующих групп пресмыкающихся. Таковы пермские зверозубые из подкласса звероподобных. Зубы ...