Еще одним усовершенствованием ДГГЭ следует считать использование гетеродуплексных фрагментов, образованных мутировавшей ДНК и ДНК дикого типа. В предыдущих опытах сравнивали подвижность гомодуплексных фрагментов мутантной и исходной ДНК в параллельных дорожках при ДГГЭ. Работа с полученными из них гетеродуплексами позволяет значительно повысить разрешающую способность метода и долю обнаруживаемых мутаций. Причина заключена в том, что неспаренные участки гетеродуплекса, в которых имеются однонуклеотидные замены, сильно снижают стзкинг-взаимодействия оснований, дестабилизируя вторичную структуру, а это, в свою очередь, приводит к снижению температуры плавления фрагмента ДНК- В ряде случаев замена всего одного нуклеотида обусловливала снижение температуры на целых 6°С. Анализ большого числа гетеродуплексов и теоретические подсчеты показывают, что все возможные замены нуклеотидов в легкоплавких доменах, приводящие к образованию неспаренных участков во фрагменте ДНК, выявляются при помощи ДГГЭ с вероятностью 100% за счет изменения подвижности. На долю легкоплавких областей во фрагментах ДНК от 100 до 1000 п.н. приходится в среднем более 50% их длины, следовательно, использование гетеродуплексов таких фрагментов позволяет выявить более половины всех возможных замен нуклеотидов. В клонированных же фрагментах ДНК с «GC-зажимом» выявляются практически все замены нуклеотидов. www.psychogood.ru

Гетеродуплексы дают возможность наблюдать изменение подвижности мутантных фрагментов ДНК в геле, не выявляемое при стандартных условиях проведения электрофореза. Зачастую единичные мутации можно обнаружить по вызываемым ими значительным изменениям структуры доменов во фрагменте ДНК-Изменения эти отражаются и на характере плавления ДНК: домены, имевшие изначально самую высокую температуру плавления, могут стать самыми легкоплавкими. Таким образом, когда вместо гомодуплексов используются гетеродуплексы, ДГГЭ позволяет выявлять замены нуклеотидов даже в самых тугоплавких доменах.

Страницы: 1 2 


Это интересно:

Реакция на стрессовые ситуации.
Самые устойчивые к стрессовым ситуациям люди – люди с I группой крови. Они живут спокойно и размеренно, разумно, успевают быстро справиться с проблемами, встающими на их пути. Они не страдают ни ложным честолюбием, ни чрезмерной скромност ...

Половые стероиды
В основе всех стероидных гормонов лежит структура циклопентанпергидрофенантрена, называемая также стерановой кольцевой системой, которая состоит из четырех насыщенных водородом конденсированных колец, три из которых являются шестичленными ...

Градиентное центрифугирование
В литературе можно встретить не одну методику очистки РСВ градиентным центрифугированием. Представленная ниже была успешно использована для очистки штамма А2. 1. Монослой клеток Нер-2 заражают РСВ. Адсорбцию проводят 2 ч при 37°С, затем ...