Еще одним усовершенствованием ДГГЭ следует считать использование гетеродуплексных фрагментов, образованных мутировавшей ДНК и ДНК дикого типа. В предыдущих опытах сравнивали подвижность гомодуплексных фрагментов мутантной и исходной ДНК в параллельных дорожках при ДГГЭ. Работа с полученными из них гетеродуплексами позволяет значительно повысить разрешающую способность метода и долю обнаруживаемых мутаций. Причина заключена в том, что неспаренные участки гетеродуплекса, в которых имеются однонуклеотидные замены, сильно снижают стзкинг-взаимодействия оснований, дестабилизируя вторичную структуру, а это, в свою очередь, приводит к снижению температуры плавления фрагмента ДНК- В ряде случаев замена всего одного нуклеотида обусловливала снижение температуры на целых 6°С. Анализ большого числа гетеродуплексов и теоретические подсчеты показывают, что все возможные замены нуклеотидов в легкоплавких доменах, приводящие к образованию неспаренных участков во фрагменте ДНК, выявляются при помощи ДГГЭ с вероятностью 100% за счет изменения подвижности. На долю легкоплавких областей во фрагментах ДНК от 100 до 1000 п.н. приходится в среднем более 50% их длины, следовательно, использование гетеродуплексов таких фрагментов позволяет выявить более половины всех возможных замен нуклеотидов. В клонированных же фрагментах ДНК с «GC-зажимом» выявляются практически все замены нуклеотидов.

Гетеродуплексы дают возможность наблюдать изменение подвижности мутантных фрагментов ДНК в геле, не выявляемое при стандартных условиях проведения электрофореза. Зачастую единичные мутации можно обнаружить по вызываемым ими значительным изменениям структуры доменов во фрагменте ДНК-Изменения эти отражаются и на характере плавления ДНК: домены, имевшие изначально самую высокую температуру плавления, могут стать самыми легкоплавкими. Таким образом, когда вместо гомодуплексов используются гетеродуплексы, ДГГЭ позволяет выявлять замены нуклеотидов даже в самых тугоплавких доменах.

Страницы: 1 2 


Это интересно:

Гепард и собака
Хотя гепарды представители семейства кошачих, немало у них и собачьих черт. Болеют, например, собачьими болезнями. Как собаки, и сидят и охотятся. Шерсть у гепардов похожа на шерсть гладкошерстных собак. А расплывчаты пятна на шкуре напом ...

Прудовое рыбное хозяйство
Рыба нерестится в прудах-озёрах "Кругляк" (площадь – 280 га) и "Костиншпиль" (площадь – 102 га). Промысловая добыча в них не ведется. Рыбопродуктивность водных объектов (озер, лиманов, водохранилищ, пригодных для ак ...

Полученные результаты и их обсуждение
Экспрессия белков клеточного цикла и Cdk 5 имеет различный уровень в исследованных отделах мозга и зависит от функционального состояния сусликов. Гибернация достоверно снижает в гиппокампе уровень экспрессии Cdc 2, Cdk 2 и Cdk 4, а экспр ...