Еще одним усовершенствованием ДГГЭ следует считать использование гетеродуплексных фрагментов, образованных мутировавшей ДНК и ДНК дикого типа. В предыдущих опытах сравнивали подвижность гомодуплексных фрагментов мутантной и исходной ДНК в параллельных дорожках при ДГГЭ. Работа с полученными из них гетеродуплексами позволяет значительно повысить разрешающую способность метода и долю обнаруживаемых мутаций. Причина заключена в том, что неспаренные участки гетеродуплекса, в которых имеются однонуклеотидные замены, сильно снижают стзкинг-взаимодействия оснований, дестабилизируя вторичную структуру, а это, в свою очередь, приводит к снижению температуры плавления фрагмента ДНК- В ряде случаев замена всего одного нуклеотида обусловливала снижение температуры на целых 6°С. Анализ большого числа гетеродуплексов и теоретические подсчеты показывают, что все возможные замены нуклеотидов в легкоплавких доменах, приводящие к образованию неспаренных участков во фрагменте ДНК, выявляются при помощи ДГГЭ с вероятностью 100% за счет изменения подвижности. На долю легкоплавких областей во фрагментах ДНК от 100 до 1000 п.н. приходится в среднем более 50% их длины, следовательно, использование гетеродуплексов таких фрагментов позволяет выявить более половины всех возможных замен нуклеотидов. В клонированных же фрагментах ДНК с «GC-зажимом» выявляются практически все замены нуклеотидов.

Гетеродуплексы дают возможность наблюдать изменение подвижности мутантных фрагментов ДНК в геле, не выявляемое при стандартных условиях проведения электрофореза. Зачастую единичные мутации можно обнаружить по вызываемым ими значительным изменениям структуры доменов во фрагменте ДНК-Изменения эти отражаются и на характере плавления ДНК: домены, имевшие изначально самую высокую температуру плавления, могут стать самыми легкоплавкими. Таким образом, когда вместо гомодуплексов используются гетеродуплексы, ДГГЭ позволяет выявлять замены нуклеотидов даже в самых тугоплавких доменах.

Страницы: 1 2 


Это интересно:

Способности и строение
Гепард действительно может нестись как вихрь. Невероятно, но этот зверь за каких-то 2 секунды с места может развить скорость 65 км/час! А потом бежать со скоростью 110 км/час! Гепард - самое быстроногое животное из наземных млекопитающих. ...

Околоводные местообитания
Фауна водных и прибрежных птиц разнообразна и обычно характеризуется высокой численностью уток, куликов, чаек и других видов, что определяется высокой кормностью природных объектов. Связь с водой у разных представителей водных и прибрежн ...

Определение содержания диеновых коньюгатов(ДК) в эритроцитах
За основу взят классический метод Placer в модификации Гаврилова В. Б. [9] для эритроцитов. 0,5 мл гемолизата эритроцитов (1:1) смешивают в пробирках с притертой крышкой с 4 мл чистоперегнанных растворов изопропанол : гептан (1:1). Смесь ...