Для проведения ПЦР, РНКазного расщепления и ДГГЭ необходимы следующие предварительные процедуры.

1. Фрагмент ДНК, тестируемый на мутации или полиморфизм, необходимо клонировать в плазмидном векторе, позволяющем синтезировать определенные типы зондов.

2. Очень полезно, а иногда и просто необходимо иметь ре-стрикционную карту такой клонированной вставки ДНК – Расположение сайтов рестрикции, особенно тех, что встречаются лишь 1–2 раза во всей плазмиде, можно определить при помощи стандартных методик рестрикционного картирования. Для обоих типов одноцепочечных зондов необходимо иметь единичный сайт рестрикции в участке тестируемой ДНК, дистальном по отношению к сайту связывания с РНК-полимеразой в случае РНК-зондов или с олигонуклеотидами в случае ДНК-зондов. После реассоциации одноцепочечного меченого ДНК-зонда с тестируемой ДНК может возникнуть необходимость расщепить гибридную последовательность ДНК на 2–3 фрагмента с оптимальной для ДГГЭ длиной. В этом случае надо использовать сайты рестрикции, имеющиеся в тестируемом фрагменте.

3. При использовании ПЦР необходимо определить концевые нуклеотидные последовательности тестируемой вставки ДНК. Обычно требуется секвенировать 40–50 п. н., чтобы получить первый набор олигонуклеотидов длиной 20–25 п. н. При работе методом «nested oligo» необходимо дополнительно просеквенировать любую последовательность внутри фрагмента ДНК, ограниченного первой парой олигонуклеотидов.


Это интересно:

Электронная микроскопия
Пневмовирусы исключительно многообразны по форме; кроме того, их вирионы и нуклеокапсиды нестабильны и легко повреждаются при обычных процедурах концентрирования вирусов. Поэтому точный подсчет вирусных частиц практически невозможен. Тра ...

Эффекторные функции антител
Основная, первичная функция антител — связывание с антигеном. В некоторых случаях оно непосредственно ведет к достижению эффекта, например, обеспечивая нейтрализацию бактериального токсина или предотвращая проникновение вируса в клетки. О ...

Определение содержания малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах
За основу взят классический метод Ernster et al [25] в модификации для эритроцитов. 0,5 мл гемолизата эритроцитов (1:1) смешивают с 1 мл охлажденной 5% ТХУ и тщательно растирают смесь стеклянной палочкой. После выдерживают при 0±5 °С не м ...