Для проведения ПЦР, РНКазного расщепления и ДГГЭ необходимы следующие предварительные процедуры.

1. Фрагмент ДНК, тестируемый на мутации или полиморфизм, необходимо клонировать в плазмидном векторе, позволяющем синтезировать определенные типы зондов.

2. Очень полезно, а иногда и просто необходимо иметь ре-стрикционную карту такой клонированной вставки ДНК – Расположение сайтов рестрикции, особенно тех, что встречаются лишь 1–2 раза во всей плазмиде, можно определить при помощи стандартных методик рестрикционного картирования. Для обоих типов одноцепочечных зондов необходимо иметь единичный сайт рестрикции в участке тестируемой ДНК, дистальном по отношению к сайту связывания с РНК-полимеразой в случае РНК-зондов или с олигонуклеотидами в случае ДНК-зондов. После реассоциации одноцепочечного меченого ДНК-зонда с тестируемой ДНК может возникнуть необходимость расщепить гибридную последовательность ДНК на 2–3 фрагмента с оптимальной для ДГГЭ длиной. В этом случае надо использовать сайты рестрикции, имеющиеся в тестируемом фрагменте.

3. При использовании ПЦР необходимо определить концевые нуклеотидные последовательности тестируемой вставки ДНК. Обычно требуется секвенировать 40–50 п. н., чтобы получить первый набор олигонуклеотидов длиной 20–25 п. н. При работе методом «nested oligo» необходимо дополнительно просеквенировать любую последовательность внутри фрагмента ДНК, ограниченного первой парой олигонуклеотидов.


Это интересно:

Основные биосенсоры на основе растительных и животных тканей
Тканевые материалы растительного и животного происхождения успешно используют в качестве биокаталитических компонентов биосенсоров. Биокаталитические материалы этого класса просто создают естественное окружение для представляющего интерес ...

Население планеты
В 1987 году на нашей планете жило более 5 миллиардов человек. Кстати, о миллиардах. Мы как-то привыкли к грандиозным цифрам и не всегда ощущаем их величие. Вероятно, вам интересно будет узнать, что толщина книги, содержащей миллиард стран ...

Основные этапы индивидуального развития человека
При изучении развития человека, его индивидуальных и возрастных особенностей в анатомии и других дисциплинах руководствуются научно обоснованными данными о возрастной периодизации. Схема возрастной периодизации развития человека, учитываю ...