Для проведения ПЦР, РНКазного расщепления и ДГГЭ необходимы следующие предварительные процедуры.

1. Фрагмент ДНК, тестируемый на мутации или полиморфизм, необходимо клонировать в плазмидном векторе, позволяющем синтезировать определенные типы зондов.

2. Очень полезно, а иногда и просто необходимо иметь ре-стрикционную карту такой клонированной вставки ДНК – Расположение сайтов рестрикции, особенно тех, что встречаются лишь 1–2 раза во всей плазмиде, можно определить при помощи стандартных методик рестрикционного картирования. Для обоих типов одноцепочечных зондов необходимо иметь единичный сайт рестрикции в участке тестируемой ДНК, дистальном по отношению к сайту связывания с РНК-полимеразой в случае РНК-зондов или с олигонуклеотидами в случае ДНК-зондов. После реассоциации одноцепочечного меченого ДНК-зонда с тестируемой ДНК может возникнуть необходимость расщепить гибридную последовательность ДНК на 2–3 фрагмента с оптимальной для ДГГЭ длиной. В этом случае надо использовать сайты рестрикции, имеющиеся в тестируемом фрагменте.

3. При использовании ПЦР необходимо определить концевые нуклеотидные последовательности тестируемой вставки ДНК. Обычно требуется секвенировать 40–50 п. н., чтобы получить первый набор олигонуклеотидов длиной 20–25 п. н. При работе методом «nested oligo» необходимо дополнительно просеквенировать любую последовательность внутри фрагмента ДНК, ограниченного первой парой олигонуклеотидов.


Это интересно:

Нативный электрофорез
При нативном электрофорезе не используются детергенты, белки разделяются как по заряду, так и по молекулярной массе. При обнаружении (возможном) не одной, а нескольких полос (загрязнение) проводится элюция с геля всех полос, затем белки и ...

Создание теоретической платформы под гелиобиологические явления, открытые А.Л. Чижевским. Современная гелиобиология – основа единой теории биологии
Выявление наборов биоритмов и гелиоритмов, характеризующихся не только длиной периодов, но и жестко фиксированными фазами колебаний, позволило к классическим вопросам гелиобиологии (как работают биологические часы и каков механизм влияния ...

Фенологическое развитие древесных растений
Под фенологическим развитием растений понимают закономерное чередование и ежегодное повторение одних и тех же фенологических циклов (вегетации и покоя, роста побегов и его прекращения, цветения, созревания плодов и семян и др.), а в преде ...