Для проведения ПЦР, РНКазного расщепления и ДГГЭ необходимы следующие предварительные процедуры.

1. Фрагмент ДНК, тестируемый на мутации или полиморфизм, необходимо клонировать в плазмидном векторе, позволяющем синтезировать определенные типы зондов.

2. Очень полезно, а иногда и просто необходимо иметь ре-стрикционную карту такой клонированной вставки ДНК – Расположение сайтов рестрикции, особенно тех, что встречаются лишь 1–2 раза во всей плазмиде, можно определить при помощи стандартных методик рестрикционного картирования. Для обоих типов одноцепочечных зондов необходимо иметь единичный сайт рестрикции в участке тестируемой ДНК, дистальном по отношению к сайту связывания с РНК-полимеразой в случае РНК-зондов или с олигонуклеотидами в случае ДНК-зондов. После реассоциации одноцепочечного меченого ДНК-зонда с тестируемой ДНК может возникнуть необходимость расщепить гибридную последовательность ДНК на 2–3 фрагмента с оптимальной для ДГГЭ длиной. В этом случае надо использовать сайты рестрикции, имеющиеся в тестируемом фрагменте.

3. При использовании ПЦР необходимо определить концевые нуклеотидные последовательности тестируемой вставки ДНК. Обычно требуется секвенировать 40–50 п. н., чтобы получить первый набор олигонуклеотидов длиной 20–25 п. н. При работе методом «nested oligo» необходимо дополнительно просеквенировать любую последовательность внутри фрагмента ДНК, ограниченного первой парой олигонуклеотидов.


Это интересно:

Размножение и развитие птиц
Особенности органов размножения. У самок большинства птиц правый яичник недоразвит и функционирует только левый. Яйца в яичнике созревают не одновременно. Развившееся яйцо, проходя по яйцеводу, оплодотворяется сперматозоидами, введенными ...

Совместные игры
Неманипуляционные игры Категория 5. Игры типа И↔И. (Устанавливаются непосредственные обоюдные связи между игровыми партнерами.) Категория 6. Игры типа И↔И(И). (С замещающим игровым партнером — животным или человеком — устана ...

В чем суть концепции атомизма? Какие структуры материи Вам известны? С какими учеными связана данная концепция? Как развивалась концепция атомизма и как она связана с современными проблемами постро
Атомизм, атомное учение, атомистика, учение о прерывистом, дискретном (зернистом) строении материи. А. утверждает, что материя состоит из отдельных чрезвычайно малых частиц; до конца 19 в. они считались неделимыми. Для современного А. хар ...