Для проведения ПЦР, РНКазного расщепления и ДГГЭ необходимы следующие предварительные процедуры.

1. Фрагмент ДНК, тестируемый на мутации или полиморфизм, необходимо клонировать в плазмидном векторе, позволяющем синтезировать определенные типы зондов.

2. Очень полезно, а иногда и просто необходимо иметь ре-стрикционную карту такой клонированной вставки ДНК – Расположение сайтов рестрикции, особенно тех, что встречаются лишь 1–2 раза во всей плазмиде, можно определить при помощи стандартных методик рестрикционного картирования. Для обоих типов одноцепочечных зондов необходимо иметь единичный сайт рестрикции в участке тестируемой ДНК, дистальном по отношению к сайту связывания с РНК-полимеразой в случае РНК-зондов или с олигонуклеотидами в случае ДНК-зондов. После реассоциации одноцепочечного меченого ДНК-зонда с тестируемой ДНК может возникнуть необходимость расщепить гибридную последовательность ДНК на 2–3 фрагмента с оптимальной для ДГГЭ длиной. В этом случае надо использовать сайты рестрикции, имеющиеся в тестируемом фрагменте.

3. При использовании ПЦР необходимо определить концевые нуклеотидные последовательности тестируемой вставки ДНК. Обычно требуется секвенировать 40–50 п. н., чтобы получить первый набор олигонуклеотидов длиной 20–25 п. н. При работе методом «nested oligo» необходимо дополнительно просеквенировать любую последовательность внутри фрагмента ДНК, ограниченного первой парой олигонуклеотидов.

Это интересно:

Причины уменьшения запасов рыб семейства кефалевых
В современных условиях у рыбной отрасли Украины есть ряд взаимообусловленных проблем. В первую очередь, следует отметить сокращение объемов добычи рыбы и морепродуктов. Рыбные запасы моря заметно скудели на глазах и как заметил профессор ...

Подготовка гомогенатов тканей и органов
Извлеченные органы (печень, головной мозг, сердце, почки) отмывали от крови физиологическим раствором, взвешивали 1-2 грамма ткани, измельчали ножницами и растирали в ступке. Все операции производили на холоду. Затем добавляли среду выдел ...

Выводы
1. Выявлено повышение активности катепсина D в плацентарной ткани при хронической внутриутробной гипоксии плода по сравнению с нормой. 2. Установлено увеличение содержания пептидов средней молекулярной массы в плаценте при хронической вн ...