Для проведения ПЦР, РНКазного расщепления и ДГГЭ необходимы следующие предварительные процедуры.

1. Фрагмент ДНК, тестируемый на мутации или полиморфизм, необходимо клонировать в плазмидном векторе, позволяющем синтезировать определенные типы зондов.

2. Очень полезно, а иногда и просто необходимо иметь ре-стрикционную карту такой клонированной вставки ДНК – Расположение сайтов рестрикции, особенно тех, что встречаются лишь 1–2 раза во всей плазмиде, можно определить при помощи стандартных методик рестрикционного картирования. Для обоих типов одноцепочечных зондов необходимо иметь единичный сайт рестрикции в участке тестируемой ДНК, дистальном по отношению к сайту связывания с РНК-полимеразой в случае РНК-зондов или с олигонуклеотидами в случае ДНК-зондов. После реассоциации одноцепочечного меченого ДНК-зонда с тестируемой ДНК может возникнуть необходимость расщепить гибридную последовательность ДНК на 2–3 фрагмента с оптимальной для ДГГЭ длиной. В этом случае надо использовать сайты рестрикции, имеющиеся в тестируемом фрагменте.

3. При использовании ПЦР необходимо определить концевые нуклеотидные последовательности тестируемой вставки ДНК. Обычно требуется секвенировать 40–50 п. н., чтобы получить первый набор олигонуклеотидов длиной 20–25 п. н. При работе методом «nested oligo» необходимо дополнительно просеквенировать любую последовательность внутри фрагмента ДНК, ограниченного первой парой олигонуклеотидов.

Это интересно:

Агранулярные лейкоциты
К этой группе лейкоцитов относятся лимфоциты и моноциты. В отличие от гранулоцитов они не содержат в цитоплазме специфической зернистости, а их ядра не сегментированы. Т-, В, О - и NK-лимфоциты (lymphocytus). В крови взрослых людей они ...

Суть и главная задача экологии
Установлено, что в природе невозможно выделить и изучить любую живую систему вне ее взаимосвязей с иными живыми системами и с неживым окружением. Поэтому в начале XX в. и в науку стали все шире проникать идет холистического (то есть целос ...

Температурная чувствительность головного мозга
В 1845 году профессор Bergman, терапевт из Берлина, выдвинул гипотезу, согласно которой термочувствительным структурам головного мозга отводилась важная роль в механизмах температурной регуляции у гомойотермных. Двадцать лет спустя д-р Лс ...