Предварительные процедуры
Для проведения ПЦР, РНКазного расщепления и ДГГЭ необходимы следующие предварительные процедуры.
1. Фрагмент ДНК, тестируемый на мутации или полиморфизм, необходимо клонировать в плазмидном векторе, позволяющем синтезировать определенные типы зондов.
2. Очень полезно, а иногда и просто необходимо иметь ре-стрикционную карту такой клонированной вставки ДНК – Расположение сайтов рестрикции, особенно тех, что встречаются лишь 1–2 раза во всей плазмиде, можно определить при помощи стандартных методик рестрикционного картирования. Для обоих типов одноцепочечных зондов необходимо иметь единичный сайт рестрикции в участке тестируемой ДНК, дистальном по отношению к сайту связывания с РНК-полимеразой в случае РНК-зондов или с олигонуклеотидами в случае ДНК-зондов. После реассоциации одноцепочечного меченого ДНК-зонда с тестируемой ДНК может возникнуть необходимость расщепить гибридную последовательность ДНК на 2–3 фрагмента с оптимальной для ДГГЭ длиной. В этом случае надо использовать сайты рестрикции, имеющиеся в тестируемом фрагменте.
3. При использовании ПЦР необходимо определить концевые нуклеотидные последовательности тестируемой вставки ДНК. Обычно требуется секвенировать 40–50 п. н., чтобы получить первый набор олигонуклеотидов длиной 20–25 п. н. При работе методом «nested oligo» необходимо дополнительно просеквенировать любую последовательность внутри фрагмента ДНК, ограниченного первой парой олигонуклеотидов.
Это интересно:
Жизненный цикл древесных растений
Под жизненным, или общим, циклом развития растений понимают их онтогенез — индивидуальное развитие растения от его возникновения из оплодотворенной яйцеклетки или вегетативной почки до естественной смерти. Как процесс, онтогенез состоит и ...
Биохимические функции живого вещества
Биохимические функции в пределах живого вещества распадаются на две части:
1. Биохимическая функция, связанная с питанием, дыханием, размножением организмов.
2. Биохимическая функция, связанная с разрушением тела отмерших организмов, то ...
Периферическая нервная система.
Чувствительные, двигательные и смешанные по функции черепные нервы. Особенности строения обонятельного (I), зрительного (II) и преддверно-улиткового (VIII) нервов специфической чувствительности в связи с развитием органов чувств. Особенно ...