Описывается синтез РНК-зондов путем транскрипции in vitro клонированных ДНК, несущих фаговый промотор. Заметим, что удельная активность таких РНК-зондов ниже, чем полученных стандартным способом и традиционно используемых при тестировании геномных ДНК. Такой активности достаточно для работы с одной десятой от общего количества ДНК, получаемой в ПЦР, или с очень небольшим объемом клонированной ДНК – Преимущество этих зондов состоит в том, что они сохраняют стабильность более 1 нед. Кроме того, длинные зонды с выступающими концами легче синтезировать так как при этом нуклеозидтрифосфаты не лимитируют реакцию транскрипции. Если исследуется геномная ДНК и не проводится ПЦР, то следует использовать зонды с высокой удельной активностью. Важно, чтобы концентрация меченого NTP в начале транскрипции была не менее 10 мкМ, поэтому для синтеза высокоактивного зонда требуется 40–80 мкКи меченого NTP.

1. В стерильной микроцентрифужной пробирке смешайте в следующем порядке:

9 мкл воды,

1 мкл рестрицированной матричной ДНК,

1 мкл смеси 3-NTP,

1 мкл «холодного» GTP,

1 мкл GTP,

2 мкл DTT,

2 мкл БСА,

2–5 единиц плацентного ингибитора РНКазы, 2 мкл 10Х буфера для транскрипции.

2. К смеси добавьте 3–5 единиц РНК-полимеразы фагов SP6, Т7 или ТЗ.

3. Инкубируйте 1 ч при 40°С, чтобы прошла транскрипция.

4. Добавьте 1 мкл ДНКазы I для разрушения матричной ДНК; инкубируйте 20 мин при 37? С.

5. Добавьте 10 мкг тРНК-носителя, 10 мкл воды и 20 мкл ацетата аммония и проэкстрагируйте один раз 2FC.

6. После экстракции водный слой осадите этанолом; ресуспендируйте осадок в 80 мл воды, 20 мл ацетата аммония и снова осадите этанолом.

7. Ресуспендируйте осадок РНК в 200 мкл ТЕ-буфера, содержащего 0,1% ДСН. Храните при –20°С.

Это интересно:

Поры в скорлупе
Итак, яйцо птицы «дышит» благодаря порам в скорлупе. Кислород поступает в яйцо, а пары воды и углекислый газ выводятся наружу. Чем больше пор и шире поровые каналы, тем быстрее проходит газообмен, и напротив, чем длиннее каналы, т.е. чем ...

Температура и жизнь. Температура влияет на все жизненно важные процессы
Формы жизни на земле - результат химических процессов в животных и растительных клетках. В процессе эволюции в организмах на разнообразных уровнях развития сформировались иерархические структуры, которые объединили в определенных системах ...

Градиентное центрифугирование
В литературе можно встретить не одну методику очистки РСВ градиентным центрифугированием. Представленная ниже была успешно использована для очистки штамма А2. 1. Монослой клеток Нер-2 заражают РСВ. Адсорбцию проводят 2 ч при 37°С, затем ...