Описывается синтез РНК-зондов путем транскрипции in vitro клонированных ДНК, несущих фаговый промотор. Заметим, что удельная активность таких РНК-зондов ниже, чем полученных стандартным способом и традиционно используемых при тестировании геномных ДНК. Такой активности достаточно для работы с одной десятой от общего количества ДНК, получаемой в ПЦР, или с очень небольшим объемом клонированной ДНК – Преимущество этих зондов состоит в том, что они сохраняют стабильность более 1 нед. Кроме того, длинные зонды с выступающими концами легче синтезировать так как при этом нуклеозидтрифосфаты не лимитируют реакцию транскрипции. Если исследуется геномная ДНК и не проводится ПЦР, то следует использовать зонды с высокой удельной активностью. Важно, чтобы концентрация меченого NTP в начале транскрипции была не менее 10 мкМ, поэтому для синтеза высокоактивного зонда требуется 40–80 мкКи меченого NTP.

1. В стерильной микроцентрифужной пробирке смешайте в следующем порядке:

9 мкл воды,

1 мкл рестрицированной матричной ДНК,

1 мкл смеси 3-NTP,

1 мкл «холодного» GTP,

1 мкл GTP,

2 мкл DTT,

2 мкл БСА,

2–5 единиц плацентного ингибитора РНКазы, 2 мкл 10Х буфера для транскрипции.

2. К смеси добавьте 3–5 единиц РНК-полимеразы фагов SP6, Т7 или ТЗ.

3. Инкубируйте 1 ч при 40°С, чтобы прошла транскрипция.

4. Добавьте 1 мкл ДНКазы I для разрушения матричной ДНК; инкубируйте 20 мин при 37? С.

5. Добавьте 10 мкг тРНК-носителя, 10 мкл воды и 20 мкл ацетата аммония и проэкстрагируйте один раз 2FC.

6. После экстракции водный слой осадите этанолом; ресуспендируйте осадок в 80 мл воды, 20 мл ацетата аммония и снова осадите этанолом.

7. Ресуспендируйте осадок РНК в 200 мкл ТЕ-буфера, содержащего 0,1% ДСН. Храните при –20°С.

Это интересно:

Критический период чувствительности к закрытию век
При закрытии век одного глаза у взрослых кошек или обезьян не наблюдается каких-либо последствий. Например, у взрослого животного, даже если глаз остается закрытым на протяжении более года, клетки в коре по прежнему получают нормальное уп ...

Данные палеогеографии
Изучение географических изменений в сопоставлении с данными об изменявшемся распространении насекомых в прошлом - еще один важный источник сведений. Примером может служить изучение насекомых пенсильванского периода, проведенное Дёрденом ( ...

Область применения
Качественный анализ, например для определения числа антигенов в различных жидкостях (сыворотке крови, цереброспинальной жидкости), для оценки чистоты препаратов при выделении антигенов, для сравнения известных антигенов и антител с неизве ...