Методы. Синтез РНК-зондов
Описывается синтез РНК-зондов путем транскрипции in vitro клонированных ДНК, несущих фаговый промотор. Заметим, что удельная активность таких РНК-зондов ниже, чем полученных стандартным способом и традиционно используемых при тестировании геномных ДНК. Такой активности достаточно для работы с одной десятой от общего количества ДНК, получаемой в ПЦР, или с очень небольшим объемом клонированной ДНК – Преимущество этих зондов состоит в том, что они сохраняют стабильность более 1 нед. Кроме того, длинные зонды с выступающими концами легче синтезировать так как при этом нуклеозидтрифосфаты не лимитируют реакцию транскрипции. Если исследуется геномная ДНК и не проводится ПЦР, то следует использовать зонды с высокой удельной активностью. Важно, чтобы концентрация меченого NTP в начале транскрипции была не менее 10 мкМ, поэтому для синтеза высокоактивного зонда требуется 40–80 мкКи меченого NTP.
1. В стерильной микроцентрифужной пробирке смешайте в следующем порядке:
9 мкл воды,
1 мкл рестрицированной матричной ДНК,
1 мкл смеси 3-NTP,
1 мкл «холодного» GTP,
1 мкл GTP,
2 мкл DTT,
2 мкл БСА,
2–5 единиц плацентного ингибитора РНКазы, 2 мкл 10Х буфера для транскрипции.
2. К смеси добавьте 3–5 единиц РНК-полимеразы фагов SP6, Т7 или ТЗ.
3. Инкубируйте 1 ч при 40°С, чтобы прошла транскрипция.
4. Добавьте 1 мкл ДНКазы I для разрушения матричной ДНК; инкубируйте 20 мин при 37? С.
5. Добавьте 10 мкг тРНК-носителя, 10 мкл воды и 20 мкл ацетата аммония и проэкстрагируйте один раз 2FC.
6. После экстракции водный слой осадите этанолом; ресуспендируйте осадок в 80 мл воды, 20 мл ацетата аммония и снова осадите этанолом.
7. Ресуспендируйте осадок РНК в 200 мкл ТЕ-буфера, содержащего 0,1% ДСН. Храните при –20°С.
Это интересно:
Работа с агарозными блок-вставками, содержащими
образцы ДНК
Для многих целей удобнее и проще иметь дело с ДНК, заключенными в агарозный гель, чем находящимися в растворе. Низкомолекулярные компоненты свободно диффундируют через агарозу при мягком перемешивании. Мы работали с 100 мкл-агарозными бло ...
Среда обитания
Осьминоги распространены по всему миру: Средиземное море, Восточный Атлантический океан, Японское море.
Обитает осьминог во всех тропических, субтропических морях и океанах (с соленостью не ниже 30%), от мелководья до глубины 100-150 м. ...
Одновременность событий
Рассмотрим восприятие одного и того же события наблюдателями, находящимися в разных ИСО.
Пусть световой сигнал излучается в центре ракеты, движущейся со скоростью v.
Наблюдатель 1 внутри ракеты считает, что свет достигает противоположны ...