В обычные пробирки наливали 0,5 мл субстрата (L – аспартат (L - аланин) 0,1 моль/л, L – кетоглутарат 2 ммоль/л, фосфатный буфер 0,1 моль/л) и 0,1 мл сыворотки крови. Параллельно ставили контрольные пробы, в которые не добавляли сыворотку. Пробы тщательно перемешивали и инкубировали в течение 1 часа – АСТ и 30 минут – АЛТ при 37С на водяной бане. После этого к опытным и контрольным пробам приливали по 0,5 мл раствора 2,4 – ДНФГ. В пробирки с контролем только после добавления 2,4 – ДНФГ приливали 0,1 мл сыворотки крови. Через 20 минут (20-25 оС) в пробирки приливали по 5 мл 0,4 моль/л раствора NaOH, хорошо перемешивали и через 5-10 минут фотометрировали против холостой пробы в интервале длин волн 500-560 нм (opt 537нм) в кюветах толщиной 1см.

Расчет активности ферментов в сыворотке крови производили по калибровочному графику. Каталитическую активность АСТ(АЛТ) рассчитывали в мкмоль/(с·л) по формуле: каталитическая концентрация АСТ(АЛТ)= (Епр – Ек)К, где К – коэффициент рассчитанный по калибровочному графику: К=С/Е, Епр – экстинция пробы, Ек – экстинция контроля.

Калибровочный график для определения активности аминотрансфераз строили таким образом, чтобы в пробах находилось от 0,05 до 0,30 мл стандартного раствора пирувата. К пробам, содержащим от 0,5 до 0,25 мл субстрата (0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 025; 0,30 мл пирувата), добавляли 0,5мл раствора 2,4 – ДНФГ, инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем во все пробирки приливали по 5 мл 0,4 Н NaOH, хорошо перемешивали и через 30 минут в пробирках № 2-6 измеряли оптическую плотность при 537 нм против раствора в пробирке № 1. Калибровочный график строили, откладывая на оси ординат значения оптической плотности для каждой пробы, а на оси абсцисс – соответствующие им значения активности АСТ и АЛТ.

Это интересно:

Гормоны плаценты при физиологически протекающей беременности и при хронической внутриутробной гипоксии плода
Фетоплацентарный комплекс играет важную роль в развитии и поддержании беременности и синтезирует ряд местных и гуморальных регуляторов, в том числе и гормональной природы. К гормонам беременности относятся: стероидные гормоны (прогестерон ...

О чем поведали меченые атомы!
Американский ученый Мэлвин Кальвин для изучения темновых реакций фотосинтеза, связанных с фиксацией и превращением углекислого газа, широко использовал метод меченых атомов. Вещества, имеющие радиоактивную метку, по химическим свойствам ...

Современная генетика
Если век XIX по праву вошел в историю мировой цивилизации как Век Физики, то стремительно завершающемуся веку XX-му, в котором нам счастливилось жить, по всей вероятности, уготовано место Века Биологии, а может быть, и Века Генетики. Сер ...