В обычные пробирки наливали 0,5 мл субстрата (L – аспартат (L - аланин) 0,1 моль/л, L – кетоглутарат 2 ммоль/л, фосфатный буфер 0,1 моль/л) и 0,1 мл сыворотки крови. Параллельно ставили контрольные пробы, в которые не добавляли сыворотку. Пробы тщательно перемешивали и инкубировали в течение 1 часа – АСТ и 30 минут – АЛТ при 37С на водяной бане. После этого к опытным и контрольным пробам приливали по 0,5 мл раствора 2,4 – ДНФГ. В пробирки с контролем только после добавления 2,4 – ДНФГ приливали 0,1 мл сыворотки крови. Через 20 минут (20-25 оС) в пробирки приливали по 5 мл 0,4 моль/л раствора NaOH, хорошо перемешивали и через 5-10 минут фотометрировали против холостой пробы в интервале длин волн 500-560 нм (opt 537нм) в кюветах толщиной 1см.

Расчет активности ферментов в сыворотке крови производили по калибровочному графику. Каталитическую активность АСТ(АЛТ) рассчитывали в мкмоль/(с·л) по формуле: каталитическая концентрация АСТ(АЛТ)= (Епр – Ек)К, где К – коэффициент рассчитанный по калибровочному графику: К=С/Е, Епр – экстинция пробы, Ек – экстинция контроля.

Калибровочный график для определения активности аминотрансфераз строили таким образом, чтобы в пробах находилось от 0,05 до 0,30 мл стандартного раствора пирувата. К пробам, содержащим от 0,5 до 0,25 мл субстрата (0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 025; 0,30 мл пирувата), добавляли 0,5мл раствора 2,4 – ДНФГ, инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем во все пробирки приливали по 5 мл 0,4 Н NaOH, хорошо перемешивали и через 30 минут в пробирках № 2-6 измеряли оптическую плотность при 537 нм против раствора в пробирке № 1. Калибровочный график строили, откладывая на оси ординат значения оптической плотности для каждой пробы, а на оси абсцисс – соответствующие им значения активности АСТ и АЛТ.

Это интересно:

Устройство микроскопа. Микроскопия в светлом поле. Устройство микроскопа
Микроскопия в светлом поле осуществляется в проходящем свете. При выполнении заданий настоящего практикума каждый студент работает с микроскопом (рис. 1). Рис. 1. Микроскоп В микроскопе различают механическую, оптическую и осветительн ...

Змеи поражают добычу вслепую
Известно, что многие виды змей даже будучи лишенными зрения способны поражать свои жертвы со сверхъестественной точностью. Рудиментарность их тепловых сенсоров не дает оснований утверждать, что одна только способность воспринимать тепло ...

Разумность братьев наших меньших
Сознание, интеллект, эмоции у животных, проявляющиеся при функционировании мозга на основе биоматериалов, точно так же могут быть реализованы любыми другими материалами или средствами, если эти материалы и средства вообще позволяют модели ...