Определение активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови

Материалы » Изучение токсического влияния кадмия на активность аминотрансфераз у потомства белых крыс » Определение активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови

В обычные пробирки наливали 0,5 мл субстрата (L – аспартат (L - аланин) 0,1 моль/л, L – кетоглутарат 2 ммоль/л, фосфатный буфер 0,1 моль/л) и 0,1 мл сыворотки крови. Параллельно ставили контрольные пробы, в которые не добавляли сыворотку. Пробы тщательно перемешивали и инкубировали в течение 1 часа – АСТ и 30 минут – АЛТ при 37С на водяной бане. После этого к опытным и контрольным пробам приливали по 0,5 мл раствора 2,4 – ДНФГ. В пробирки с контролем только после добавления 2,4 – ДНФГ приливали 0,1 мл сыворотки крови. Через 20 минут (20-25 оС) в пробирки приливали по 5 мл 0,4 моль/л раствора NaOH, хорошо перемешивали и через 5-10 минут фотометрировали против холостой пробы в интервале длин волн 500-560 нм (opt 537нм) в кюветах толщиной 1см.

Расчет активности ферментов в сыворотке крови производили по калибровочному графику. Каталитическую активность АСТ(АЛТ) рассчитывали в мкмоль/(с·л) по формуле: каталитическая концентрация АСТ(АЛТ)= (Епр – Ек)К, где К – коэффициент рассчитанный по калибровочному графику: К=С/Е, Епр – экстинция пробы, Ек – экстинция контроля.

Калибровочный график для определения активности аминотрансфераз строили таким образом, чтобы в пробах находилось от 0,05 до 0,30 мл стандартного раствора пирувата. К пробам, содержащим от 0,5 до 0,25 мл субстрата (0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 025; 0,30 мл пирувата), добавляли 0,5мл раствора 2,4 – ДНФГ, инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем во все пробирки приливали по 5 мл 0,4 Н NaOH, хорошо перемешивали и через 30 минут в пробирках № 2-6 измеряли оптическую плотность при 537 нм против раствора в пробирке № 1. Калибровочный график строили, откладывая на оси ординат значения оптической плотности для каждой пробы, а на оси абсцисс – соответствующие им значения активности АСТ и АЛТ.


Это интересно:

Определение содержания МДА в плазме крови и печени
За основу взят классический метод Mihara et al. [30]. 0,4 мл плазмы крови смешивают с 4 мл охлажденной 1,4% ортофосфорной кислоты и 2 мл 0,5% тиобарбитуровой кислоты. Смесь инкубируют в кипящей бане 45 мин после чего охлаждают и добавляют ...

Дарлингтония
Единственный вид, входящий в род, называется дарлингтония калифорнийская - D. californica, растет на калифорнийских болотах. (Darlingtonia californica), многолетнее травянистое насекомоядное растение семейства Саррацениевых с корневищем ...

Эмбриональное развитие
Этап I. Перед началом дробления. Стадия 1. Икринка не обводняется, в первые минуты после оплодотворения, яйцо прозрачно, пигментированная оболочка плотно прилегает к поверхности яйца. Стадия 2. Начало обводнения икринки и образование ...