Выделение митопластов из митохондрий печени крыс

Для одного выделения обычно декапитировали 10 крыс, у которых извлекали печень.

Печень измельчали в специальном прессе, затем гомогенизировали в десятикратном объеме 300 мМ раствора сахарозы в 10 мМ Tris-HCl, рН 7.4 с использованием автоматического гомогенизатора при 240 об/мин.

Далее гомогенат центрифугировали на центрифуге К-70: 4 мин при 1200 об/мин (400g), затем 6 мин при 1500 об/мин (600g). В этих условиях осаждаются ядра и мембранные структуры.

Супернатант центрифугировали на РС-6 20 мин при 4800 об/мин (3500g). В этих условиях осаждается митохондриальная фракция. Осадок собирали и промывали в 300 мМ раствора сахарозы в 10 мМ Tris-HCl рН 7.4, затем ресуспендировали.

Повторное центрифугирование проводили на РС-6 20 мин. при 4800 об/мин (3500g). Осадок собирали, мерили его объем.

Доводили полученные митохондрии Tris-HCl (10 мМ, pH 7.4) до 500 мл.

Оставляли при перемешивании и температуре 4°С на 30 мин. В результате получались митопласты.

Митопласты центрифугировали при 5500 об/мин на РС-6 (4000g) в течение 20 мин.

Осадок объединяли. Измеряли его объем и концентрацию белка. Концентрацию белка измеряли спектрофотометрически (длина волны 750 нм) по методу Лоури (Лоури, 1965). Исходя из полученных данных, митопласты разводили бидистиллированной водой до концентрации 44 мг/мл.


Это интересно:

Радиальная скорость роста грибов на естественных субстратах
На рисунке 3 приведены зависимости радиальной скорости роста от времени у исследуемых грибов на различных природных целлюлозных материалах. листья камыш кора опилки сено Рис. 3. Радиальная скорость роста ...

Химический состав белков
В яичном белке недостаточно лизина организма для млекопитающих (дефицит лизина равен примерно 6%). Добавление этой аминокислоты ускоряет рост животных. Белки коровьего молока содержат избыток лизина, лейцина, триптофана, гистидина и трео ...

Лактозопермеаза из е. Соli
Этот комплекс изучен наиболее полно из всех симпортных белков. Он кодируется lacY-геном, который является частью lac-оперона, и его часто называют lac-пермеазой. Ген lacY был клонирован и секвенирован, и из штамма-сверхпродуцента был выде ...