Для одного выделения обычно декапитировали 10 крыс, у которых извлекали печень.

Печень измельчали в специальном прессе, затем гомогенизировали в десятикратном объеме 300 мМ раствора сахарозы в 10 мМ Tris-HCl, рН 7.4 с использованием автоматического гомогенизатора при 240 об/мин.

Далее гомогенат центрифугировали на центрифуге К-70: 4 мин при 1200 об/мин (400g), затем 6 мин при 1500 об/мин (600g). В этих условиях осаждаются ядра и мембранные структуры.

Супернатант центрифугировали на РС-6 20 мин при 4800 об/мин (3500g). В этих условиях осаждается митохондриальная фракция. Осадок собирали и промывали в 300 мМ раствора сахарозы в 10 мМ Tris-HCl рН 7.4, затем ресуспендировали.

Повторное центрифугирование проводили на РС-6 20 мин. при 4800 об/мин (3500g). Осадок собирали, мерили его объем.

Доводили полученные митохондрии Tris-HCl (10 мМ, pH 7.4) до 500 мл.

Оставляли при перемешивании и температуре 4°С на 30 мин. В результате получались митопласты.

Митопласты центрифугировали при 5500 об/мин на РС-6 (4000g) в течение 20 мин.

Осадок объединяли. Измеряли его объем и концентрацию белка. Концентрацию белка измеряли спектрофотометрически (длина волны 750 нм) по методу Лоури (Лоури, 1965). Исходя из полученных данных, митопласты разводили бидистиллированной водой до концентрации 44 мг/мл.

Это интересно:

Особенности микроскопических грибов, выделенных из различных экониш. Влияние экологических условий на рост микромицетов. Сравнительный анализ скорости радиального роста микромицетов, выделенных из
На сегодня экологические проблемы становятся не менее актуальными, чем запросы микробиологической промышленности (Кочкина, 1978; Великанов, 1983; Жданова, 1982-2000; Паников, 1991). Надежды на их решение связывают с так называемым системн ...

Генная инженерия в медицинской микробиологии
Генная инженерия- раздел молекулярной генетики, связанный с конструированием несуществующих в природе сочетаний генов при помощи генетических и биохимических методов. Метод генетической инженерии относится к числу перспективнейших при по ...

Цитоплазма и ее органоиды
Цитоплазма. Цитоплазма, отграниченная от внешней среды наружной мембраной, заполняет всю клетку, и в ней располагаются различные органоиды и ядро. Это внутренняя полужидкая среда клетки, которая содержит большое количество воды, а из орг ...