При нативном электрофорезе не используются детергенты, белки разделяются как по заряду, так и по молекулярной массе. При обнаружении (возможном) не одной, а нескольких полос (загрязнение) проводится элюция с геля всех полос, затем белки идентифицируются на SDS-форезе.

Концентрированный буфер для элюции (рН=8.8): 3г Tris на 500 мл воды; 14.4 г глицина на 500 мл воды.

Буфер для элюции: концентрированный буфер развести в 10 раз.

Приготовление гелей: сведения представлены в таблице 4.

Таблица 4. Приготовление гелей для нативного электрофореза.

10% гель:

2.5% гель:

30% акриламид – 3.3 мл

30% акриламид – 0.5 мл

1% бис-акриламид - 1.3 мл

1% бис-акриламид – 0.5 мл

1.5 М трис (рН=8.7) – 2.5 мл

0.5 М трис (рН = 6.8) – 1.25 мл

вода - 2.73 мл

вода – 2.67 мл

персульфат аммония - 0.035 мл

персульфат аммония - 0.025 мл

ТЕМЕД – 0.003 мл

ТЕМЕД – 0.0025 мл

Пластинки заливали рабочим буфером для фореза. Проводили префорез: 30 мА 30 мин.

Бромфеноловый синий в кислой среде бурый, при рН 8.3 синеет. Краску наносили на гель ровным слоем и устанавливали силу тока 30 мА на 1 мин, чтобы краска вошла в гель.

Добавляли сахарозу и глицерин для увеличения плотности раствора. В краску тоже добавляли сахарозу.

Когда краска входила в гель, наносили пробу ровным слоем. Устанавливали силу тока 30 мА (примерно на 3 часа).

После этого, вырезали боковые части геля, окрасили их 30 минут бромфеноловым синим, отмывали в 7.5% уксусной кислоте. Вырезали полосу геля, соответствующую полосе белка (должна быть чуть шире, чем полоса белка), измельчали, помещали в трубку для элюции.

Пробирки заполняли буфером, потом заливали буфер в верхнюю камеру, чтобы покрыло пробки. В наружной камере буфер должен покрывать мембрану.

Камеру ставили в холодильник, проводили элюцию при 8 мА (для двух трубок) 12 часов. Доэлюцию (если было необходимо) проводили при 10 мА 1 час.

После этого, сливали буфер из внутренней камеры во внешнюю. Из трубок пипеткой вытягивали буфер. Аккуратно снимали пробку – в ней препарат. Осторожно, чтобы не повредить мембрану, вытягивали пипеткой элюат.


Это интересно:

Определение ХС-ЛОНП (холестерина-липопротеидов очень низкой плотности) расчетным методом
Уровень ХС-ЛОНП находят путем деления показателя концентрации триацилглицеринов на 2,2 (ТГ/2,2). Вывод этой формулы расчетов базируется на том, что, во-первых, при отсутствии в крови хиломикронов (а они после 12-часового голодания у больш ...

Другие функции почек
Регуляция кислотно-щелочного равновесия. Почки участвуют наряду с легкими в регуляции КЩР (кислотно-щелочного равновесия). Прежде всего это осуществляется за счет регуляции процесса реабсорбции бикарбоната натрия, составной части бикарбон ...

Определение параметров дыхания с помощью кислородного электрода Кларка
Среда для электрода (рН 7.4): 150 мМ сахароза; 50 мМ хлорид калия; 5 мМ дигидрофосфат натрия; 0.5 мМ хлорид магния; 10 мМ хепес. Использовали прибор «Record 4». Калибровку шкалы выполняли по двум точкам. «Ноль» нмоль кислорода устанавлив ...