Нативный электрофорез
При нативном электрофорезе не используются детергенты, белки разделяются как по заряду, так и по молекулярной массе. При обнаружении (возможном) не одной, а нескольких полос (загрязнение) проводится элюция с геля всех полос, затем белки идентифицируются на SDS-форезе.
Концентрированный буфер для элюции (рН=8.8): 3г Tris на 500 мл воды; 14.4 г глицина на 500 мл воды.
Буфер для элюции: концентрированный буфер развести в 10 раз.
Приготовление гелей: сведения представлены в таблице 4.
Таблица 4. Приготовление гелей для нативного электрофореза.
10% гель: |
2.5% гель: |
30% акриламид – 3.3 мл |
30% акриламид – 0.5 мл |
1% бис-акриламид - 1.3 мл |
1% бис-акриламид – 0.5 мл |
1.5 М трис (рН=8.7) – 2.5 мл |
0.5 М трис (рН = 6.8) – 1.25 мл |
вода - 2.73 мл |
вода – 2.67 мл |
персульфат аммония - 0.035 мл |
персульфат аммония - 0.025 мл |
ТЕМЕД – 0.003 мл |
ТЕМЕД – 0.0025 мл |
Пластинки заливали рабочим буфером для фореза. Проводили префорез: 30 мА 30 мин.
Бромфеноловый синий в кислой среде бурый, при рН 8.3 синеет. Краску наносили на гель ровным слоем и устанавливали силу тока 30 мА на 1 мин, чтобы краска вошла в гель.
Добавляли сахарозу и глицерин для увеличения плотности раствора. В краску тоже добавляли сахарозу.
Когда краска входила в гель, наносили пробу ровным слоем. Устанавливали силу тока 30 мА (примерно на 3 часа).
После этого, вырезали боковые части геля, окрасили их 30 минут бромфеноловым синим, отмывали в 7.5% уксусной кислоте. Вырезали полосу геля, соответствующую полосе белка (должна быть чуть шире, чем полоса белка), измельчали, помещали в трубку для элюции.
Пробирки заполняли буфером, потом заливали буфер в верхнюю камеру, чтобы покрыло пробки. В наружной камере буфер должен покрывать мембрану.
Камеру ставили в холодильник, проводили элюцию при 8 мА (для двух трубок) 12 часов. Доэлюцию (если было необходимо) проводили при 10 мА 1 час.
После этого, сливали буфер из внутренней камеры во внешнюю. Из трубок пипеткой вытягивали буфер. Аккуратно снимали пробку – в ней препарат. Осторожно, чтобы не повредить мембрану, вытягивали пипеткой элюат.
Это интересно:
Дыхание. Определение. Уравнение. Значение дыхания в жизни растительного
организма. Специфика дыхания у растений
Образующиеся в ходе фотосинтеза сахара и другие органические соединения используются клетками растительного организма в качестве питательных веществ. Клетки незеленых частей и все клетки растения в темноте питаются веществами углеводной п ...
Закон единообразия гибридов первого поколения (первый закон Менделя)
Данный закон утверждает, что скрещивание особей, различающихся по данному признаку (гомозиготных по разным аллелям), дает генетически однородное потомство (поколение F 1), все особи которого гетерозиготны. Все гибриды F 1 могут иметь при ...
Практическое значение млекопитающих
Промысловые звери.
Из 350 видов млекопитающих фауны нашей страны примерно 150 видов потенциально могут служить объектами промысловой и спортивной охоты или отлова в целях расселения и содержания
в зоопарках в лесопарках. Больше всего так ...