При нативном электрофорезе не используются детергенты, белки разделяются как по заряду, так и по молекулярной массе. При обнаружении (возможном) не одной, а нескольких полос (загрязнение) проводится элюция с геля всех полос, затем белки идентифицируются на SDS-форезе.

Концентрированный буфер для элюции (рН=8.8): 3г Tris на 500 мл воды; 14.4 г глицина на 500 мл воды.

Буфер для элюции: концентрированный буфер развести в 10 раз.

Приготовление гелей: сведения представлены в таблице 4.

Таблица 4. Приготовление гелей для нативного электрофореза.

Пластинки заливали рабочим буфером для фореза. Проводили префорез: 30 мА 30 мин.

Бромфеноловый синий в кислой среде бурый, при рН 8.3 синеет. Краску наносили на гель ровным слоем и устанавливали силу тока 30 мА на 1 мин, чтобы краска вошла в гель.

Добавляли сахарозу и глицерин для увеличения плотности раствора. В краску тоже добавляли сахарозу.

Когда краска входила в гель, наносили пробу ровным слоем. Устанавливали силу тока 30 мА (примерно на 3 часа).

После этого, вырезали боковые части геля, окрасили их 30 минут бромфеноловым синим, отмывали в 7.5% уксусной кислоте. Вырезали полосу геля, соответствующую полосе белка (должна быть чуть шире, чем полоса белка), измельчали, помещали в трубку для элюции.

Пробирки заполняли буфером, потом заливали буфер в верхнюю камеру, чтобы покрыло пробки. В наружной камере буфер должен покрывать мембрану.

Камеру ставили в холодильник, проводили элюцию при 8 мА (для двух трубок) 12 часов. Доэлюцию (если было необходимо) проводили при 10 мА 1 час.

После этого, сливали буфер из внутренней камеры во внешнюю. Из трубок пипеткой вытягивали буфер. Аккуратно снимали пробку – в ней препарат. Осторожно, чтобы не повредить мембрану, вытягивали пипеткой элюат.

Это интересно:

Приготовление питательных сред
Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла. Перед употреблением посуду тщательно мыли, полоскали и высушивали. Среды варили в стеклянных колбах объемом 250 ...

Биосферный цикл азота
Цикл азота - пример сложного круговорота газообразных веществ, способных к быстрой саморегуляции. Схема цикла может быть представлена следующим образом: Атмосферный азот связывается при разрядах молний и в результате жизнедеятельности аз ...

Сопоставьте понятия "популяция" и "вид". Докажите, что популяция является единицей эволюции. Почему разные популяции одного вида отличаются по частоте генов?
Популяция - структурная единица вида. Популяция - совокупность особей одного вида, занимающих определенный ареал, свободно скрещивающихся друг с другом, имеющих общее происхождение, генетическую основу и в той или иной степени изолированн ...