При нативном электрофорезе не используются детергенты, белки разделяются как по заряду, так и по молекулярной массе. При обнаружении (возможном) не одной, а нескольких полос (загрязнение) проводится элюция с геля всех полос, затем белки идентифицируются на SDS-форезе.

Концентрированный буфер для элюции (рН=8.8): 3г Tris на 500 мл воды; 14.4 г глицина на 500 мл воды.

Буфер для элюции: концентрированный буфер развести в 10 раз.

Приготовление гелей: сведения представлены в таблице 4.

Таблица 4. Приготовление гелей для нативного электрофореза.

10% гель:

2.5% гель:

30% акриламид – 3.3 мл

30% акриламид – 0.5 мл

1% бис-акриламид - 1.3 мл

1% бис-акриламид – 0.5 мл

1.5 М трис (рН=8.7) – 2.5 мл

0.5 М трис (рН = 6.8) – 1.25 мл

вода - 2.73 мл

вода – 2.67 мл

персульфат аммония - 0.035 мл

персульфат аммония - 0.025 мл

ТЕМЕД – 0.003 мл

ТЕМЕД – 0.0025 мл

Пластинки заливали рабочим буфером для фореза. Проводили префорез: 30 мА 30 мин.

Бромфеноловый синий в кислой среде бурый, при рН 8.3 синеет. Краску наносили на гель ровным слоем и устанавливали силу тока 30 мА на 1 мин, чтобы краска вошла в гель.

Добавляли сахарозу и глицерин для увеличения плотности раствора. В краску тоже добавляли сахарозу.

Когда краска входила в гель, наносили пробу ровным слоем. Устанавливали силу тока 30 мА (примерно на 3 часа).

После этого, вырезали боковые части геля, окрасили их 30 минут бромфеноловым синим, отмывали в 7.5% уксусной кислоте. Вырезали полосу геля, соответствующую полосе белка (должна быть чуть шире, чем полоса белка), измельчали, помещали в трубку для элюции.

Пробирки заполняли буфером, потом заливали буфер в верхнюю камеру, чтобы покрыло пробки. В наружной камере буфер должен покрывать мембрану.

Камеру ставили в холодильник, проводили элюцию при 8 мА (для двух трубок) 12 часов. Доэлюцию (если было необходимо) проводили при 10 мА 1 час.

После этого, сливали буфер из внутренней камеры во внешнюю. Из трубок пипеткой вытягивали буфер. Аккуратно снимали пробку – в ней препарат. Осторожно, чтобы не повредить мембрану, вытягивали пипеткой элюат.


Это интересно:

Происхождение и эволюция млекопитающих
Предками млекопитающих были примитивные палеозойские рептилии, еще не успевшие приобрести узкую специализацию, столь характерную для большинства последующих групп пресмыкающихся. Таковы пермские зверозубые из подкласса звероподобных. Зубы ...

Дихотомический путь. Гликолиз. Механизмы регуляции цикла. Энергетическая эффективность процесса, значение. Связь с другими процессами
Гликолиз — процесс анаэробного распада глюкозы, идущий Гликолиз с освобождением энергии, конечным продуктом которого является пировиноградная кислота. Гликолиз — общий начальный этап аэробного дыхания и всех видов брожения. Реакции глико ...

Медуница неясная
(Pulmonaria obscura Dumort.), семейство Бурачниковые (Buraginaceae) В отличие от ветреницы лютиковой этот эфемероидвстречается в наших лиственных лесах все реже и реже. Причиной тому служит сведение лесов - мест произрастания этого расте ...