Среда выделения (200 мл, рН 7.4): маннитол 210 мМ; сахароза 70 мМ; HEPES (N-2-гидроксиэтилперазин–N’-этансульфоновая кислота) 10 мМ. Среду разделяли на три части. В одну 37 мг ЭДТА на 100 мл среды, в другую 45 мкл 0,1 М ЭГТА на 100 мл среды. Третью (три миллилитра) оставляли без изменений.

Все процедуры проводили при 4 °С. Взвешенный физраствор предварительно охлаждали. Затем взвешивали вместе с печенью. Измельчали печень в прессе, затем гомогенизировали, разбавив средой с ЭДТА в девять раз.

Центрифугировали 4 мин при 250 g, затем 6 мин при 600 g. В результате этого осаждались ядра и обрывки мембран.

Супернатант центрифугировали 20 мин при 4500 g.

Осадок ресуспендировали в среде с ЭГТА и центрифугировали 20 мин при 4500 g.

Осадок ресуспендировали в среде без ЭГТА и без ЭДТА в соотношении 100 мкл среды на каждый грамм ткани и ставили в лед.


Это интересно:

Эпидемии в новейшей истории
Ценой огромных жертв и усилий человечество научилось-таки бороться со многими из болезней, рассмотренных в первой главе. Казалось, что все самое страшное позади. Но в конце прошлого тысячелетия человек столкнулся с новыми коварными врагам ...

Древнейшие предки человека.
Ученые выделяют три стадии антропогенеза: 1. Антропоидные предки человека. 2. Архантропы и палеоантропы (древнейшие и древние люди). 3. Люди современного морфологического типа. ...

Класс многощетинковые кольчецы (polychaeta)
Полихеты названы так потому, что параподии у них включают пучки многочисленных щетинок. Всего насчитывается 6 тыс. полихет. Полихеты – типичные морские животные и очень редко встречаются в пресной воде. Распространение и среда обитания. ...