Среда выделения (200 мл, рН 7.4): маннитол 210 мМ; сахароза 70 мМ; HEPES (N-2-гидроксиэтилперазин–N’-этансульфоновая кислота) 10 мМ. Среду разделяли на три части. В одну 37 мг ЭДТА на 100 мл среды, в другую 45 мкл 0,1 М ЭГТА на 100 мл среды. Третью (три миллилитра) оставляли без изменений.

Все процедуры проводили при 4 °С. Взвешенный физраствор предварительно охлаждали. Затем взвешивали вместе с печенью. Измельчали печень в прессе, затем гомогенизировали, разбавив средой с ЭДТА в девять раз.

Центрифугировали 4 мин при 250 g, затем 6 мин при 600 g. В результате этого осаждались ядра и обрывки мембран.

Супернатант центрифугировали 20 мин при 4500 g.

Осадок ресуспендировали в среде с ЭГТА и центрифугировали 20 мин при 4500 g.

Осадок ресуспендировали в среде без ЭГТА и без ЭДТА в соотношении 100 мкл среды на каждый грамм ткани и ставили в лед.


Это интересно:

Общая схема региональной дифференцировки
Рострокаудальный и дорзовентральный градиенты факторов транскрипции определяют локальную идентификацию клеток в пределах ЦНС. Эти же факторы способны приводить к развитию довольно различных свойств в зависимости от того, в каком месте эмб ...

Радуга флоры
Уж коли мы заговорили о пигментах растений, следует рассказать и о причинах разнообразия окраски цветков. Зачем цветкам их яркая, сочная окраска? В конечном счете для того, чтобы привлечь к себе насекомых-опылителей. Многие растения опыл ...

Простая радиальная иммунодиффузия по Манчини. Принцип
На ровную поверхность равномерным слоем наносят гель, содержащий антитела. В геле вырезают лунки и заполняют их раствором антигена. Молекулы антигена радиально диффундируют из лунки и, встретившись с антителами, образуют кольцо преципитац ...