Твердофазный иммуноферментный анализ является наиболее популярным методом в диагностике различных вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных болезней человека и животных. Однако этот метод имеет ряд недостатков. В модифицированном варианте для адсорбции различных антигенов используют нитроцеллюлозные фильтры. Такую модификацию называют dot-ELISA (точечный твердофазный иммуноферментный анализ). В dot-ELISA минимальные объемы растворов антигена или антител наносят на нитроцеллюлозную подложку в виде серии точек. Преципитирующие хромогенные субстраты на белом нитроцеллюлозном фильтре образуют цветные пятна. Фильтры с результатами анализа могут храниться в темноте в течение многих лет без потери окраски.

В dot-ELISA можно применять различные препараты антигенов. На нитроцеллюлозных мембранах можно сорбировать как жизнеспособные или фиксированные формалином простейшие, так и супернатанты, полученные после разрушения клеток.

Пятно антигена наносят в объеме от 0,1 до 3 мкл. В случае препаратов солюбизированных антигенов предпочтительнее использовать мембраны с малым диаметром пор. При применении целых клеток величина пор не играет большой роли.

Все стадии инкубации и промывки выполняют при комнатной температуре. Сначала диски с антигеном обрабатывают блокирующим раствором (3 – 5%-ный раствор очищенного бычьего сывороточного альбумина в солевом триэтаноламиновом буферном растворе). Можно успешно применять и цельную лошадиную сыворотку или 1%-ный раствор нормальной сыворотки кролика в фосфатном буферном растворе с NaCl. При обнаружении антител 50 мкл сыворотки в 1%-ном растворе БСА-СТБ инкубируют на диске. Антитела специфически связываются с антигеном, сорбированном на диске. Затем диски трижды промывают в растворе детергента (0,05%-ный раствор нонидета Р-40 в СТБ, 0,05%-ный раствор твина-20 в солевом растворе трис- НCl). После промывки диски инкубируют с 50 мкл конъюгата аффинно очищенных антивидовых антител с ферментом (пероксидаза, щелочная фосфатаза).

После отмывки несвязавшегося материала добавляют преципитирующий хромогенный субстрат. При окислении субстрата ферментом в присутствии пероксида водорода образуется четкое пятно.

При определении антигенов пробы наносят непосредственно на подложку, затем проводят иммунологическую реакцию или со специфическими антителами и конъюгатом вторичных антител с ферментом и хромогенным субстратом, или с конъюгатом специфических антител с ферментом-маркером и субстратом.

В двухсайтовом dot-ELISA при определении антигенов сначала на подложку наносят специфические антитела. Антигены в пробе связываются с антителами. Потом добавляют меченые специфические антитела против другого эпитопа антигена и проводят реакцию с преципитирующим субстратом. Для таких методик характерна высокая специфичность.

Важным преимуществом метода dot-ELISA является возможность его применения для самых разнообразных медицинских целей. Все модификации dot-ELISA отличаются экономичным расходом реагентов, не требуют приборов с электропитанием для регистрации результатов


Это интересно:

Витамин B5
Витамин B5 (никотиновая кислота, никотина-мид, витамин РР, ниацинамид). Это группа водорастворимых соединений, включающих пиридинтрикарбоновую кислоту и ее производные. Суточная потребность взрослого человека – 15-20 мг. Он необходим в по ...

Синергетика – наука о сложном
В последние годы наблюдается стремительный и бурный рост интереса к междисциплинарному направлению, получившему название “синергетика”. Издаются солидные монографии, учебники, выходят сотни статей, проводятся национальные и международные ...

Общие понятия, основные вехи биотехнологии
Биотехнология возникла на стыке микробиологии, биохимии и биофизики, генетики и цитологии, биоорганической химии и молекулярной биологии, иммунологии и молекулярной генетики. Методы биотехнологии могут применяться на следующих уровнях: мо ...