Иммунофлуоресцентные методы

Материалы » Группа пневмовирусов » Иммунофлуоресцентные методы

Иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью поликлональной антисыворотки представляет собой удобный и точный метод подсчета зараженных клеток и выявления места размножения вируса при анализе фиксированных срезов зараженных тканей. Используя моноклональные антитела против индивидуальных вирусных полипептидов, иммунофлуоресцентным методом можно изучать и внутриклеточную локализацию вирусных антигенов.

Иммунофлуоресцентное окрашивание применяется также для быстрой диагностики вирусных инфекций. Это направление недавно рассмотрено в исчерпывающих обзорах, а конкретные методы обнаружения РСВ в клиническом материале описаны в работе Гарднера и др. Иммунофлуоресценция - более точный метод выявления РСВ в организме больного, чем непосредственное выделение вируса, поскольку в период реконвалесценции после вызванного РСВ заболевания зараженные клетки бывают покрыты противовирусными антителами.

Непрямая иммунофлуоресценция более чувствительна, чем прямая, однако при ее использовании возникает проблема неспецифической флуоресценции. Ее можно устранить предварительным истощением антисыворотки и антииммуноглобулинового конъюгата обработанной ацетоном культурой клеток или гомогенатом печени животных. Обработка клеток ацетоном проводится следующим образом:

1. 10s-109 клеток снимают со стекла и получают суспензию.

2. Клетки концентрируют центрифугированием и ресуспендируют в 0,01 М PBS; эту процедуру повторяют трижды.

3. Осадок клеток ресуспендируют: 5 мин в 10-кратном объеме ацетона и вновь осаждают клетки.

4. Клетки ресуспендируют в 0,01 М PBS и проводят 6 циклов осаждения для полного удаления ацетона. После этого клетки можно хранить до употребления в 0,01 М PBS при - 20 °С.

Ниже приведена стандартная методика для выявления антигенов РСВ в зараженных клетках методом непрямой иммунофлуоресценции.

1. В пластиковые чашки диаметром 50 мм помещают тщательно вымытые и дегидратированные этанолом покровные стекла и высевают по ЫО6 клеток BS-C-1. Инкубируют клетки 24 ч, промывают и заражают РСВ с множественностью инфекции около 1 БОЕ/кл.

2. После адсорбции вируса в течение 2 ч покровные стекла с зараженными клетками тщательно промывают средой MEM, содержащей 2,5% ЭТС, и инкубируют при 31 или 39 °С.

3. Через 40-48 ч после заражения клетки фиксируют на 5 мин в охлажденном до 4°С ацетоне, высушивают на воздухе 30 мин и хранят при - 20 °С.

4. Антивирусную сыворотку истощают обработанными ацетоном клетками BS-C-1 при 4°С и используют в подобранном оптимальном разведении. Кроличья сыворотка против глобулинов нескольких видов животных, конъюгированная с изотиоцианатом флуоресцеина, имеется в продаже. Конъюгат истощают обработанным ацетоном гомогенатом печени мыши или клетками BS-C-1 при 4°С.

5. Покровные стекла инкубируют с антивирусной сывороткой 1 ч при 37 °С, промывают и инкубируют еще 45 мин при 37 °С с соответствующим конъюгатом.

6. После промывки препараты заключают в забуференный глицерин и исследуют под флуоресцентным микроскопом. Рис.3 иллюстрирует разрешение, которое может быть получено при использовании данного метода.

Доказательствами специфичности иммунофлуоресценции могут служить:

1) отсутствие флуоресценции незараженных клеток BS-C-1;

2) отсутствие флуоресценции при использовании ЭТС вместо специфической с зараженными РСВ клетками;

3) отсутствие флуоресценции после истощения противовирусной сыворотки зараженными клетками.

Высокой чувствительностью обладает и иммунопероксидазный метод; его преимущество состоит в том, что он не требует использования микроскопа с ультрафиолетовой оптикой.


Это интересно:

Клонирование животных
Пожалуй, одним из наиболее ярких достижений генетики за последнее время является эксперимент по клонированию овцы, успешно завершенный 23 февраля 1997 года учеными Рослинского университета в Шотландии под руководством Яна Вилмута. Для того ...

Взаимопревращение органических веществ в растении.
Метаболизм или обмен веществ - это совокупность всех химических реакций, направленных на самоорганизацию и самовоспроизведение, это важнейшее свойство жизни и непременный ее признак у всех клеточных организмов. Поступившие в растение нео ...

Методы стабилизации инфекционное
Инфекционность РСВ стабилизируется в присутствии высоких концентраций сахарозы или ионов магния. Ферни и Герин сообщили, что в присутствии 1 М MgS04 стабильность РСВ возросла в 30 раз и период полужизни инфекционного вируса при 4°С увелич ...