Иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью поликлональной антисыворотки представляет собой удобный и точный метод подсчета зараженных клеток и выявления места размножения вируса при анализе фиксированных срезов зараженных тканей. Используя моноклональные антитела против индивидуальных вирусных полипептидов, иммунофлуоресцентным методом можно изучать и внутриклеточную локализацию вирусных антигенов.

Иммунофлуоресцентное окрашивание применяется также для быстрой диагностики вирусных инфекций. Это направление недавно рассмотрено в исчерпывающих обзорах, а конкретные методы обнаружения РСВ в клиническом материале описаны в работе Гарднера и др. Иммунофлуоресценция - более точный метод выявления РСВ в организме больного, чем непосредственное выделение вируса, поскольку в период реконвалесценции после вызванного РСВ заболевания зараженные клетки бывают покрыты противовирусными антителами.

Непрямая иммунофлуоресценция более чувствительна, чем прямая, однако при ее использовании возникает проблема неспецифической флуоресценции. Ее можно устранить предварительным истощением антисыворотки и антииммуноглобулинового конъюгата обработанной ацетоном культурой клеток или гомогенатом печени животных. Обработка клеток ацетоном проводится следующим образом:

1. 10s-109 клеток снимают со стекла и получают суспензию.

2. Клетки концентрируют центрифугированием и ресуспендируют в 0,01 М PBS; эту процедуру повторяют трижды.

3. Осадок клеток ресуспендируют: 5 мин в 10-кратном объеме ацетона и вновь осаждают клетки.

4. Клетки ресуспендируют в 0,01 М PBS и проводят 6 циклов осаждения для полного удаления ацетона. После этого клетки можно хранить до употребления в 0,01 М PBS при - 20 °С.

Ниже приведена стандартная методика для выявления антигенов РСВ в зараженных клетках методом непрямой иммунофлуоресценции.

1. В пластиковые чашки диаметром 50 мм помещают тщательно вымытые и дегидратированные этанолом покровные стекла и высевают по ЫО6 клеток BS-C-1. Инкубируют клетки 24 ч, промывают и заражают РСВ с множественностью инфекции около 1 БОЕ/кл.

2. После адсорбции вируса в течение 2 ч покровные стекла с зараженными клетками тщательно промывают средой MEM, содержащей 2,5% ЭТС, и инкубируют при 31 или 39 °С.

3. Через 40-48 ч после заражения клетки фиксируют на 5 мин в охлажденном до 4°С ацетоне, высушивают на воздухе 30 мин и хранят при - 20 °С.

4. Антивирусную сыворотку истощают обработанными ацетоном клетками BS-C-1 при 4°С и используют в подобранном оптимальном разведении. Кроличья сыворотка против глобулинов нескольких видов животных, конъюгированная с изотиоцианатом флуоресцеина, имеется в продаже. Конъюгат истощают обработанным ацетоном гомогенатом печени мыши или клетками BS-C-1 при 4°С.

5. Покровные стекла инкубируют с антивирусной сывороткой 1 ч при 37 °С, промывают и инкубируют еще 45 мин при 37 °С с соответствующим конъюгатом.

6. После промывки препараты заключают в забуференный глицерин и исследуют под флуоресцентным микроскопом. Рис.3 иллюстрирует разрешение, которое может быть получено при использовании данного метода.

Доказательствами специфичности иммунофлуоресценции могут служить:

1) отсутствие флуоресценции незараженных клеток BS-C-1;

2) отсутствие флуоресценции при использовании ЭТС вместо специфической с зараженными РСВ клетками;

3) отсутствие флуоресценции после истощения противовирусной сыворотки зараженными клетками.

Высокой чувствительностью обладает и иммунопероксидазный метод; его преимущество состоит в том, что он не требует использования микроскопа с ультрафиолетовой оптикой.

Это интересно:

Суточные ритмы органов и тканей
На сегодняшний день установлено, что именно супрахиазматическое ядро посылает сигналы в центры мозга, ответственные за циклическую выработку гормонов-регуляторов суточной активности организма. Одним из таких регуляторных центров служит па ...

Суточная норма потребления белка
Основными источниками белка в питании являются мясные, рыбные, молочные и зернобобовые продукты. Больше всего нормы потребления белка содержится в сырах - около 25%, в горохе и фасоли - 22-23%. Для того чтобы более тщательно была описана ...

Фундаментальные типы взаимодействий в физике. Почему они так называются? Какие законы сохранения фундаментальны для всего естествознания и почему?
В настоящее время известны четыре фундаментальных типа взаимодействий: гравитационное, слабое, электромагнитное и сильное. Слабое взаимодействие отвечает, например, за бета-распады ядер, электромагнитное - связывает электрон и протон в а ...