Очистка матричной РНК для трансляции

Материалы » Группа пневмовирусов » Очистка матричной РНК для трансляции

Матричную РНК для трансляции in vitro получают следующим образом.

1. 50-Ю6 клеток заражают РСВ. Клетки инкубируют 10-12 ч при 37 °С.

2. Монослой промывают, снимают клетки со стекла и суспендируют в буферном растворе. Суспензию оставляют на 10 мин при 4°С для набухания клеток.

3. Клетки разрушают в гомогенизаторе Даунса, затем осаждают клеточный и дебрис центрифугированием при 4°С.;

4. Осадок ресуспендируют в 2 мл того же буфера, вновь гомогенизируют и центрифугируют. Супернатанты, полученные после первого и второго центрифугирований, объединяют.

5. К супернатанту добавляют CsCl и N-лаурилсаркозин. Раствор тщательно перемешивают и прогревают 1-2 мин при 51 °С.

6. 7 мл полученного раствора наслаивают на 2 мл раствора в пробирке для ротора SW40 и добавляют сверху буфер, чтобы заполнить пробирку. Пробирки центрифугируют в роторе SW40 16 ч при 25000 об/мин и 25 °С.

7. Осадок ресуспендируют в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды. РНК дважды переосаждают этанолом, добавляя 1,2 мл этанола, 25 мкл 4 М раствора NaCl и 10 мкл 10% -ного ДДС-Na.

8. После второго осаждения осадок ресуспендируют в буфере, добавляют ДДС-Na до концентрации 0,2% и проводят хроматографию на колонке с олиго - целлюлозой. Связавшийся материал элюируют и осаждают РНК этанолом, добавляя в ка* честве носителя тРНК из печени кролика. Осадок ресуспендируют в том же буфере без ДДС-Na и переосаждают РНК двумя объемами этанола в присутствии 0,2 М ацетата калия. Конечный осадок ресуспендируют в 250-500 мкл 0,01 М HEPES, рН 7,6. В качестве бесклеточной системы для синтеза белка можно использовать зависимый от мРНК лизат ретикулоцитов кролика, приготовленный, как описано Престоном, или коммерческий препарат лизата. Для контроля следует параллельно получить мРНК из незараженных клеток. Индивидуальные вирусные мРНК для трансляции в бесклеточной системе можно выделить методом гибридизационной селекции с использованием клонов кДНК с известной структурой, как описано Коллинзом и Вертц.


Это интересно:

Влияние сельскохозяйственной деятельности человека на окружающую среду
В процессе развития общества меняются характер и масштабы воздействия человека на природу. С возникновением оседлого сельского хозяйства в начале неолита (3—8-е тысячелетия до н. э.) воздействие человека на биосферу по сравнению с кочевым ...

Растительные яды. Алкалоиды
Известно, что из одних и тех же растений готовили и лекарства и яды. В Древнем Египте мякоть плодов персика входила в состав лекарственных средств, а из ядер косточек и листьев жрецы готовили очень сильный яд, содержащий синильную кислоту ...

Общие свойства белков
В желудке, где выделяются соляная кислота и пепсин, под влиянием повышенной кислотности и фермента происходят частичная денатурация (изменение, третичной структуры) свойства белка и его расщепление на крупные фрагменты. В кишечнике частич ...