Выявление белков клеточного цикла и циклинзависимой киназы Cdk5

Мембрану с перенесенными белками блокировали в течение 15 – 16 ч для предотвращения неспецифического связывания в 5% растворе обезжиренного молока в TBST (50 мМ Tris/Cl , pH=7,5; 0,9% NaCl; 0,05% Tween 20), после чего инкубировали с различными разведениями специфических первичных антител в 5% молоке в TBST 2ч при комнатной температуре или 15-16ч при 40С. Для удаления несвязавшихся антител мембрану отмывали 4-х кратно в TBST в течение 30 мин. Связавшиеся первичные антитела выявляли с помощью вторичных антител, полученных у другого вида животных против первичных, конъюгированных с пероксидазой хрена. Связывание антител визуализировали на рентгеновской пленке с использованием хемилюминесцентной системы, которая в присутствии пероксидазы хрена окисляется с выделением квантов света.

Детекцию белков проводили в оптимальных условиях, которые были подобраны ранее.

Таблица 1

Условия иммунодетекции исследуемых белков при Вестерн-блот анализе.

Белок

1 Ab

Разведение

2Ab

Разведение

MCM 2

Goat polyclonal (козьи поликлональные)

1:500

Rabbit-anti-Goat (кроличьи антикозьи)

1:2000

Cn B1

Rabbit polyclonal (кроличьи поликлональные)

1:1000

Goat-anti-Rabbit (козьи антикроличьи)

1:2000

Cn A

Rabbit polyclonal

1:1000

Goat-anti-Rabbit

1:1000

Cdc 2

Rabbit polyclonal

1:1000

Goat-anti-Rabbit

1:2000

Cdk 2

Rabbit polyclonal

1:500

Goat-anti-Rabbit

1:2000

Cdk 4

Rabbit polyclonal

1:1000

Goat-anti-Rabbit

1:2000

Cdk 5

Rabbit polyclonal

1:1000

Goat-anti-Rabbit

1:2000


Это интересно:

Ферменты плаценты при физиологическом течении беременности и при хронической внутриутробной гипоксии плода
В снабжении плода питательными веществами и продуктами обмена важную роль играют ферменты плаценты, которые локализуются в основном внутриклеточно. Среди них следует выделить группу дыхательных ферментов: оксидазы, каталаза, НАД - и НАДФ- ...

Значение волос и перьев
При низкой температуре воздуха у млекопитающих приподнимаются волосы, а птицы расправляют свои перья. ")то сопровождается возрастанием пограничного слоя и лучшей изоляцией оболочки тела. У многих видов птиц эта форма температурной ре ...

Сенсор уксусной кислоты
При выращивании микроорганизмов на уксусной кислоте как источнике углерода избыток кислоты подавляет их рост и, следовательно, ее оптимальную концентрацию следует поддерживать с помощью непрерывного контроля в режиме "на линии". ...