Выявление белков клеточного цикла и циклинзависимой киназы Cdk5

Мембрану с перенесенными белками блокировали в течение 15 – 16 ч для предотвращения неспецифического связывания в 5% растворе обезжиренного молока в TBST (50 мМ Tris/Cl , pH=7,5; 0,9% NaCl; 0,05% Tween 20), после чего инкубировали с различными разведениями специфических первичных антител в 5% молоке в TBST 2ч при комнатной температуре или 15-16ч при 40С. Для удаления несвязавшихся антител мембрану отмывали 4-х кратно в TBST в течение 30 мин. Связавшиеся первичные антитела выявляли с помощью вторичных антител, полученных у другого вида животных против первичных, конъюгированных с пероксидазой хрена. Связывание антител визуализировали на рентгеновской пленке с использованием хемилюминесцентной системы, которая в присутствии пероксидазы хрена окисляется с выделением квантов света.

Детекцию белков проводили в оптимальных условиях, которые были подобраны ранее.

Таблица 1

Условия иммунодетекции исследуемых белков при Вестерн-блот анализе.

Белок

1 Ab

Разведение

2Ab

Разведение

MCM 2

Goat polyclonal (козьи поликлональные)

1:500

Rabbit-anti-Goat (кроличьи антикозьи)

1:2000

Cn B1

Rabbit polyclonal (кроличьи поликлональные)

1:1000

Goat-anti-Rabbit (козьи антикроличьи)

1:2000

Cn A

Rabbit polyclonal

1:1000

Goat-anti-Rabbit

1:1000

Cdc 2

Rabbit polyclonal

1:1000

Goat-anti-Rabbit

1:2000

Cdk 2

Rabbit polyclonal

1:500

Goat-anti-Rabbit

1:2000

Cdk 4

Rabbit polyclonal

1:1000

Goat-anti-Rabbit

1:2000

Cdk 5

Rabbit polyclonal

1:1000

Goat-anti-Rabbit

1:2000


Это интересно:

Особенности городского ландшафта. Типы биотопов
Поселения человека представляют собой часть культурного ландшафта. Поселения человека – деревни, села, города и различные искусственные сооружения в сочетании с культурными площадями во многих случаях заменяют животным их природные станци ...

Размеры и пропорции, масса тела
Среди размеров тела выделяют тотальные (от фр. total - целиком) и парциальные (от лат. pars - часть). Тотальные (общие) размеры тела - основные показатели физического развития человека. К ним относятся длина и масса тела, а также обхват г ...

Генная инженерия
Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия. Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в «фабрики» для масшт ...