Выявление белков клеточного цикла и циклинзависимой киназы Cdk5
Мембрану с перенесенными белками блокировали в течение 15 – 16 ч для предотвращения неспецифического связывания в 5% растворе обезжиренного молока в TBST (50 мМ Tris/Cl , pH=7,5; 0,9% NaCl; 0,05% Tween 20), после чего инкубировали с различными разведениями специфических первичных антител в 5% молоке в TBST 2ч при комнатной температуре или 15-16ч при 40С. Для удаления несвязавшихся антител мембрану отмывали 4-х кратно в TBST в течение 30 мин. Связавшиеся первичные антитела выявляли с помощью вторичных антител, полученных у другого вида животных против первичных, конъюгированных с пероксидазой хрена. Связывание антител визуализировали на рентгеновской пленке с использованием хемилюминесцентной системы, которая в присутствии пероксидазы хрена окисляется с выделением квантов света.
Детекцию белков проводили в оптимальных условиях, которые были подобраны ранее.
Таблица 1
Условия иммунодетекции исследуемых белков при Вестерн-блот анализе.
Белок |
1 Ab |
Разведение |
2Ab |
Разведение |
MCM 2 |
Goat polyclonal (козьи поликлональные) |
1:500 |
Rabbit-anti-Goat (кроличьи антикозьи) |
1:2000 |
Cn B1 |
Rabbit polyclonal (кроличьи поликлональные) |
1:1000 |
Goat-anti-Rabbit (козьи антикроличьи) |
1:2000 |
Cn A |
Rabbit polyclonal |
1:1000 |
Goat-anti-Rabbit |
1:1000 |
Cdc 2 |
Rabbit polyclonal |
1:1000 |
Goat-anti-Rabbit |
1:2000 |
Cdk 2 |
Rabbit polyclonal |
1:500 |
Goat-anti-Rabbit |
1:2000 |
Cdk 4 |
Rabbit polyclonal |
1:1000 |
Goat-anti-Rabbit |
1:2000 |
Cdk 5 |
Rabbit polyclonal |
1:1000 |
Goat-anti-Rabbit |
1:2000 |
Это интересно:
Особенности размножения и плодовитость
Ласка – полигамное животное, самец в период гона может покрывать несколько самок. Половозрелость особей наступает в возрасте около 3 месяцев. Некоторые самки ласки уже в этом возрасте приступают к размножению и способны принести потомство ...
Собственное время
Собственное время – время, измеренное наблюдателем, движущимся вместе с часами.
При этом в соответствии со вторым постулатом СТО движение светового импульса должно происходить со скоростью света с, одинаковой во всех ИСО. ...
Статическая физика и вопросы, которые она изучает
Статистическая физика, раздел физики, задача которого — выразить свойства макроскопических тел, т. е. систем, состоящих из очень большого числа одинаковых частиц (молекул, атомов, электронов и т.д.), через свойства этих частиц и взаимодей ...