Выявление белков клеточного цикла и циклинзависимой киназы Cdk5

Мембрану с перенесенными белками блокировали в течение 15 – 16 ч для предотвращения неспецифического связывания в 5% растворе обезжиренного молока в TBST (50 мМ Tris/Cl , pH=7,5; 0,9% NaCl; 0,05% Tween 20), после чего инкубировали с различными разведениями специфических первичных антител в 5% молоке в TBST 2ч при комнатной температуре или 15-16ч при 40С. Для удаления несвязавшихся антител мембрану отмывали 4-х кратно в TBST в течение 30 мин. Связавшиеся первичные антитела выявляли с помощью вторичных антител, полученных у другого вида животных против первичных, конъюгированных с пероксидазой хрена. Связывание антител визуализировали на рентгеновской пленке с использованием хемилюминесцентной системы, которая в присутствии пероксидазы хрена окисляется с выделением квантов света.

Детекцию белков проводили в оптимальных условиях, которые были подобраны ранее.

Таблица 1

Условия иммунодетекции исследуемых белков при Вестерн-блот анализе.

Белок

1 Ab

Разведение

2Ab

Разведение

MCM 2

Goat polyclonal (козьи поликлональные)

1:500

Rabbit-anti-Goat (кроличьи антикозьи)

1:2000

Cn B1

Rabbit polyclonal (кроличьи поликлональные)

1:1000

Goat-anti-Rabbit (козьи антикроличьи)

1:2000

Cn A

Rabbit polyclonal

1:1000

Goat-anti-Rabbit

1:1000

Cdc 2

Rabbit polyclonal

1:1000

Goat-anti-Rabbit

1:2000

Cdk 2

Rabbit polyclonal

1:500

Goat-anti-Rabbit

1:2000

Cdk 4

Rabbit polyclonal

1:1000

Goat-anti-Rabbit

1:2000

Cdk 5

Rabbit polyclonal

1:1000

Goat-anti-Rabbit

1:2000


Это интересно:

Оценка биологического возраста
Для того чтобы следить за процессами старения человека, и своевременно осуществлять действия по увеличению активной работоспособности, полноценной, трудоспособной жизни необходимы современные методы диагностики процессов, связанных со ста ...

Основные этапы становления учения о дыхании растений
Если, по Лавуазье, дыхание имеет сходство с процессом горения, то каким же образом органические вещества могут «гореть» при обычной температуре тела организма, да еще в водной среде, (ведь на 70 — 90% масса живых организмов состоит из вод ...

Птенец вылупляется
Существуют у птичьих яиц и другие проблемы. Если поры в скорлупе ничем не прикрыты, то поровые каналы работают как капилляры и вода легко проникает по ним в яйцо. Это может быть дождевая вода, принесенная на оперении насиживающей птицы. А ...