Выявление белков клеточного цикла и циклинзависимой киназы Cdk5
Мембрану с перенесенными белками блокировали в течение 15 – 16 ч для предотвращения неспецифического связывания в 5% растворе обезжиренного молока в TBST (50 мМ Tris/Cl , pH=7,5; 0,9% NaCl; 0,05% Tween 20), после чего инкубировали с различными разведениями специфических первичных антител в 5% молоке в TBST 2ч при комнатной температуре или 15-16ч при 40С. Для удаления несвязавшихся антител мембрану отмывали 4-х кратно в TBST в течение 30 мин. Связавшиеся первичные антитела выявляли с помощью вторичных антител, полученных у другого вида животных против первичных, конъюгированных с пероксидазой хрена. Связывание антител визуализировали на рентгеновской пленке с использованием хемилюминесцентной системы, которая в присутствии пероксидазы хрена окисляется с выделением квантов света.
Детекцию белков проводили в оптимальных условиях, которые были подобраны ранее.
Таблица 1
Условия иммунодетекции исследуемых белков при Вестерн-блот анализе.
Белок |
1 Ab |
Разведение |
2Ab |
Разведение |
MCM 2 |
Goat polyclonal (козьи поликлональные) |
1:500 |
Rabbit-anti-Goat (кроличьи антикозьи) |
1:2000 |
Cn B1 |
Rabbit polyclonal (кроличьи поликлональные) |
1:1000 |
Goat-anti-Rabbit (козьи антикроличьи) |
1:2000 |
Cn A |
Rabbit polyclonal |
1:1000 |
Goat-anti-Rabbit |
1:1000 |
Cdc 2 |
Rabbit polyclonal |
1:1000 |
Goat-anti-Rabbit |
1:2000 |
Cdk 2 |
Rabbit polyclonal |
1:500 |
Goat-anti-Rabbit |
1:2000 |
Cdk 4 |
Rabbit polyclonal |
1:1000 |
Goat-anti-Rabbit |
1:2000 |
Cdk 5 |
Rabbit polyclonal |
1:1000 |
Goat-anti-Rabbit |
1:2000 |
Это интересно:
Биоритмы и биологические часы. Каково их биологическое значение в жизни
организмов?
Изучением ритмов активности и пассивности, протекающих в нашем организме, занимается особая наука – биоритмология. Согласно этой науке, большинство процессов, происходящих в организме, синхронизированы с периодическими солнечно-лунно-земн ...
Центральная нервная система
1. Передний мозг 2. Промежуточный мозг 3. Гипофиз 4. Средний мозг и его боковые выпячивания 5. Продолговатый мозг 6. Мозжечок 7. Обонятельные доля и нерв 8. Эпифиз 9. Базальный ганглий 10. Зрительный нерв
Головной мозг птиц развивался в ...
Росолист
Росолист (Dr osophyllum lusitanicum L.) — одно из наиболее замечательных насекомоядных растений, произрастающее в Португалии и в Марокко. Растение отличается от других насекомоядных (Drosera, Pinguicula) как своей внешностью, так в особен ...