Выявление белков клеточного цикла и циклинзависимой киназы Cdk5

Мембрану с перенесенными белками блокировали в течение 15 – 16 ч для предотвращения неспецифического связывания в 5% растворе обезжиренного молока в TBST (50 мМ Tris/Cl , pH=7,5; 0,9% NaCl; 0,05% Tween 20), после чего инкубировали с различными разведениями специфических первичных антител в 5% молоке в TBST 2ч при комнатной температуре или 15-16ч при 40С. Для удаления несвязавшихся антител мембрану отмывали 4-х кратно в TBST в течение 30 мин. Связавшиеся первичные антитела выявляли с помощью вторичных антител, полученных у другого вида животных против первичных, конъюгированных с пероксидазой хрена. Связывание антител визуализировали на рентгеновской пленке с использованием хемилюминесцентной системы, которая в присутствии пероксидазы хрена окисляется с выделением квантов света.

Детекцию белков проводили в оптимальных условиях, которые были подобраны ранее.

Таблица 1

Условия иммунодетекции исследуемых белков при Вестерн-блот анализе.

Белок

1 Ab

Разведение

2Ab

Разведение

MCM 2

Goat polyclonal (козьи поликлональные)

1:500

Rabbit-anti-Goat (кроличьи антикозьи)

1:2000

Cn B1

Rabbit polyclonal (кроличьи поликлональные)

1:1000

Goat-anti-Rabbit (козьи антикроличьи)

1:2000

Cn A

Rabbit polyclonal

1:1000

Goat-anti-Rabbit

1:1000

Cdc 2

Rabbit polyclonal

1:1000

Goat-anti-Rabbit

1:2000

Cdk 2

Rabbit polyclonal

1:500

Goat-anti-Rabbit

1:2000

Cdk 4

Rabbit polyclonal

1:1000

Goat-anti-Rabbit

1:2000

Cdk 5

Rabbit polyclonal

1:1000

Goat-anti-Rabbit

1:2000


Это интересно:

Теория самоорганизации
Небезызвестный Г.Беккер недaвно получил Нобелевскую премию зa теорию экономической мотивaции социaльных явлений, однaко те же сaмые мотивaции элементaрно следуют из принципa нaименьшего действия, известного в физике кaк минимум сотню лет. ...

Список сокращений
АО - антиоксиданты АКМ – активные кислородные метаболиты АС - атеросклероз БОТ – бутилокситолуол ВЖР – высокожировой рацион ГМК - гладкомышечные клетки ДК – диеновые коньюгаты ИА - индекс атерогенности ЛНП – липопротеиды низкой пл ...

Исследовательская часть
Изучив теоретический материал по выбранной мной теме, я провела свои наблюдения за поведением ласточек деревенских в период их гнездования и сравнила с наблюдениями ученых орнитологов, которые их проводили в Ленинградской области (М.В.Кол ...