Выявление белков клеточного цикла и циклинзависимой киназы Cdk5
Мембрану с перенесенными белками блокировали в течение 15 – 16 ч для предотвращения неспецифического связывания в 5% растворе обезжиренного молока в TBST (50 мМ Tris/Cl , pH=7,5; 0,9% NaCl; 0,05% Tween 20), после чего инкубировали с различными разведениями специфических первичных антител в 5% молоке в TBST 2ч при комнатной температуре или 15-16ч при 40С. Для удаления несвязавшихся антител мембрану отмывали 4-х кратно в TBST в течение 30 мин. Связавшиеся первичные антитела выявляли с помощью вторичных антител, полученных у другого вида животных против первичных, конъюгированных с пероксидазой хрена. Связывание антител визуализировали на рентгеновской пленке с использованием хемилюминесцентной системы, которая в присутствии пероксидазы хрена окисляется с выделением квантов света.
Детекцию белков проводили в оптимальных условиях, которые были подобраны ранее.
Таблица 1
Условия иммунодетекции исследуемых белков при Вестерн-блот анализе.
Белок |
1 Ab |
Разведение |
2Ab |
Разведение |
MCM 2 |
Goat polyclonal (козьи поликлональные) |
1:500 |
Rabbit-anti-Goat (кроличьи антикозьи) |
1:2000 |
Cn B1 |
Rabbit polyclonal (кроличьи поликлональные) |
1:1000 |
Goat-anti-Rabbit (козьи антикроличьи) |
1:2000 |
Cn A |
Rabbit polyclonal |
1:1000 |
Goat-anti-Rabbit |
1:1000 |
Cdc 2 |
Rabbit polyclonal |
1:1000 |
Goat-anti-Rabbit |
1:2000 |
Cdk 2 |
Rabbit polyclonal |
1:500 |
Goat-anti-Rabbit |
1:2000 |
Cdk 4 |
Rabbit polyclonal |
1:1000 |
Goat-anti-Rabbit |
1:2000 |
Cdk 5 |
Rabbit polyclonal |
1:1000 |
Goat-anti-Rabbit |
1:2000 |
Это интересно:
«Лес, точно терем расписной, лиловый, золотой, багряный»
Изменение окраски листьев – одна из первых примет осени. Много ярких красок в осеннем лесу! Березы, ясени и липы желтеют, розовеют листья бересклета, пунцово-красными становятся узорные листья рябины, оранжевыми и багряными листья осин. Ч ...
Маркеры активации на
лимфоцитах
Активация Т- и В-клеток вызывает синтез de novo ряда поверхностных маркеров и увеличение экспрессии других.
К этим маркерам активации относятся молекулы межклеточной адгезии, обеспечивающие более эффективное взаимодействие активированных ...
Изучение параметров АТФ-зависимого транспорта ионов калия в митохондриях
Исследование параметров проводилось на двух моделях:
А) Модель энергозависимого набухания митохондрий.
Увеличение концентрации ионов К+ матриксе провоцирует осмотически облигатное поступление воды и, следовательно, набухание митохондрий ...