Ферментативная обработка

Для ферментативной обработки ДНК, содержащейся в блок-вставке, необходимо предварительно инактивировать протеинкиназу К, оставшуюся после приготовления образца, и убрать диализом ЭДТА и детергенты. Протеиназа К весьма устойчивый фермент и может оставаться активной в растворе ESP при 4°С по крайней мере 1 год. Однако она полностью инактивируется при обработке фенилметилсульфонилфторидом, который крайне нестабилен и свежий раствор, которого поэтому надо добавлять ежедневно. Любая остающаяся во вставке протеиназа К разрушит вносимые ферменты. Необходима чрезвычайная аккуратность, чтобы не загрязнять лабораторный стол и используемое оборудование протеиназой К. В правильно выбранной агарозе эффективными будут если не все, то большинство рестриктаз. Когда рестриктазы не активны в агарозе, они, как правило, не проявляют активность и в растворе. Обычно мы используем соотношение фермент: ДНК, равное 20: 1. В большинстве случаев это соответствует по крайней мере 10-кратному превышению над реально необходимым количеством фермента. Наш опыт, основанный на использовании ДНК и рестриктаз из различных источников, а также опыт других исследователей подсказывает, что именно такой подход гарантирует полноту рестрикции. В случае низкой концентрации ДНК, особенно при работе с бактериями, может оказаться необходимым повысить концентрацию рестриктаз. Для частичного рестриктазного гидролиза необходимо титровать отдельные рестриктазы, добавляя различное их количество к вставкам с образцами ДНК и инкубируя в течение 2,5 ч.


Это интересно:

Ядовитые ягоды
Собирая ягоды, не спутайте съедобные и полезные с ядовитыми! Некоторые из них настолько похожи на съедобные ягоды (вишни, черную смородину, тутовник), что представляют собой постоянную опасность. НЕКОТОРЫЕ ЯДОВИТЫЕ ЯГОДЫ. Арум Другие н ...

Источники важнейших микроэлементов пищи
ЙОД - морская капуста, изделия из нее, морская рыба (треска, минтай, сайра и др.), кальмары, креветки, мясо, молоко. Беднее йодом куриные яйца, говяжья печень. На морском побережье часть необходимого йода человек получает с воздухом. МА ...

Какими бывают чернила
Сохранился очень вкусный древнеримский рецепт чернил: надо взять много винограда… и съесть его! А косточки выплюнуть, сжечь и полученную сажу смешать с маслом. Когда читаешь про старые способы получения чернил, то, кажется, что их сочиня ...