Для ферментативной обработки ДНК, содержащейся в блок-вставке, необходимо предварительно инактивировать протеинкиназу К, оставшуюся после приготовления образца, и убрать диализом ЭДТА и детергенты. Протеиназа К весьма устойчивый фермент и может оставаться активной в растворе ESP при 4°С по крайней мере 1 год. Однако она полностью инактивируется при обработке фенилметилсульфонилфторидом, который крайне нестабилен и свежий раствор, которого поэтому надо добавлять ежедневно. Любая остающаяся во вставке протеиназа К разрушит вносимые ферменты. Необходима чрезвычайная аккуратность, чтобы не загрязнять лабораторный стол и используемое оборудование протеиназой К. В правильно выбранной агарозе эффективными будут если не все, то большинство рестриктаз. Когда рестриктазы не активны в агарозе, они, как правило, не проявляют активность и в растворе. Обычно мы используем соотношение фермент: ДНК, равное 20: 1. В большинстве случаев это соответствует по крайней мере 10-кратному превышению над реально необходимым количеством фермента. Наш опыт, основанный на использовании ДНК и рестриктаз из различных источников, а также опыт других исследователей подсказывает, что именно такой подход гарантирует полноту рестрикции. В случае низкой концентрации ДНК, особенно при работе с бактериями, может оказаться необходимым повысить концентрацию рестриктаз. Для частичного рестриктазного гидролиза необходимо титровать отдельные рестриктазы, добавляя различное их количество к вставкам с образцами ДНК и инкубируя в течение 2,5 ч.

Это интересно:

Единая теория Вселенной или теория всего
Единая теория Вселенной, или Теория всего - гипотетическая объединенная физико-математическая теория, описывающая все известные фундаментальные взаимодействия. Первоначально данный термин использовался в ироническом ключе для обозначения ...

Разнообразие пород домашней кошки
Гималайская кошка – это результат скрещивания персидских кошек с сиамскими. Название «гималайская» происходит от типа окраса гималайского кролика, чей оттенок на морде, ногах и хвосте резко и плавно осветляется по отношению к остальной ча ...

Азовское и Черное моря как среда обитания кефалевых. Исторический аспект проблемы
Вопрос о продуктивности моря и проблемы, связанные с ним, всегда, во все времена волновали людей. Но особо остро он стал перед человечеством с развитием цивилизации. Интенсивный вылов рыбы, в том числе из семейства кефалевые и падение пр ...