Для ферментативной обработки ДНК, содержащейся в блок-вставке, необходимо предварительно инактивировать протеинкиназу К, оставшуюся после приготовления образца, и убрать диализом ЭДТА и детергенты. Протеиназа К весьма устойчивый фермент и может оставаться активной в растворе ESP при 4°С по крайней мере 1 год. Однако она полностью инактивируется при обработке фенилметилсульфонилфторидом, который крайне нестабилен и свежий раствор, которого поэтому надо добавлять ежедневно. Любая остающаяся во вставке протеиназа К разрушит вносимые ферменты. Необходима чрезвычайная аккуратность, чтобы не загрязнять лабораторный стол и используемое оборудование протеиназой К. В правильно выбранной агарозе эффективными будут если не все, то большинство рестриктаз. Когда рестриктазы не активны в агарозе, они, как правило, не проявляют активность и в растворе. Обычно мы используем соотношение фермент: ДНК, равное 20: 1. В большинстве случаев это соответствует по крайней мере 10-кратному превышению над реально необходимым количеством фермента. Наш опыт, основанный на использовании ДНК и рестриктаз из различных источников, а также опыт других исследователей подсказывает, что именно такой подход гарантирует полноту рестрикции. В случае низкой концентрации ДНК, особенно при работе с бактериями, может оказаться необходимым повысить концентрацию рестриктаз. Для частичного рестриктазного гидролиза необходимо титровать отдельные рестриктазы, добавляя различное их количество к вставкам с образцами ДНК и инкубируя в течение 2,5 ч.

Это интересно:

Сезонные миграции
По характеру миграций различают оседлых (строго оседлых и полуоседлых), кочующих и перелетных птиц. Оседлые птицы могут постоянно жить в гнездовой территории, как из вороновых поступают галки, постоянно живущие рядом с человеческими посел ...

Язык животных. Общение разных видов животных.
Так как языковые знаки могут быть интенциональными (производимыми намеренно, на основе знания их смысловых значений) и неинтенциональными (производимыми ненамеренно), то данный вопрос нужно конкретизировать, сформулировав так: пользуются ...

Происхождение клеток и индукционные взаимодействия в простых нервных системах
Происхождение клеток наиболее хорошо исследовано на примере простых беспозвоночных, таких как пиявка, кузнечик, плодовая муха и маленькая нематода Caenorhabditis elegans. В этих препаратах возможно проследить развитие каждой клетки и иссл ...