Для ферментативной обработки ДНК, содержащейся в блок-вставке, необходимо предварительно инактивировать протеинкиназу К, оставшуюся после приготовления образца, и убрать диализом ЭДТА и детергенты. Протеиназа К весьма устойчивый фермент и может оставаться активной в растворе ESP при 4°С по крайней мере 1 год. Однако она полностью инактивируется при обработке фенилметилсульфонилфторидом, который крайне нестабилен и свежий раствор, которого поэтому надо добавлять ежедневно. Любая остающаяся во вставке протеиназа К разрушит вносимые ферменты. Необходима чрезвычайная аккуратность, чтобы не загрязнять лабораторный стол и используемое оборудование протеиназой К. В правильно выбранной агарозе эффективными будут если не все, то большинство рестриктаз. Когда рестриктазы не активны в агарозе, они, как правило, не проявляют активность и в растворе. Обычно мы используем соотношение фермент: ДНК, равное 20: 1. В большинстве случаев это соответствует по крайней мере 10-кратному превышению над реально необходимым количеством фермента. Наш опыт, основанный на использовании ДНК и рестриктаз из различных источников, а также опыт других исследователей подсказывает, что именно такой подход гарантирует полноту рестрикции. В случае низкой концентрации ДНК, особенно при работе с бактериями, может оказаться необходимым повысить концентрацию рестриктаз. Для частичного рестриктазного гидролиза необходимо титровать отдельные рестриктазы, добавляя различное их количество к вставкам с образцами ДНК и инкубируя в течение 2,5 ч.

Это интересно:

Филогенетические отношения
Вторым, не столь прямым источником данных служит анализ морфологических сходств и различий современных насекомых, позволяющий установить филогенетические отношения. При таком анализе ищут примитивные черты в строении насекомых и пытаются ...

Количественные показатели газообмена
Дыхательный контроль. Возрастание функциональной активности клеток сопровождается усилением дыхания. В значительной степени это достигается благодаря механизму дыхательного контроля, или акцепторного контроля дыхания. Дыхательным .контро ...

Данные палеогеографии
Изучение географических изменений в сопоставлении с данными об изменявшемся распространении насекомых в прошлом - еще один важный источник сведений. Примером может служить изучение насекомых пенсильванского периода, проведенное Дёрденом ( ...