Для ферментативной обработки ДНК, содержащейся в блок-вставке, необходимо предварительно инактивировать протеинкиназу К, оставшуюся после приготовления образца, и убрать диализом ЭДТА и детергенты. Протеиназа К весьма устойчивый фермент и может оставаться активной в растворе ESP при 4°С по крайней мере 1 год. Однако она полностью инактивируется при обработке фенилметилсульфонилфторидом, который крайне нестабилен и свежий раствор, которого поэтому надо добавлять ежедневно. Любая остающаяся во вставке протеиназа К разрушит вносимые ферменты. Необходима чрезвычайная аккуратность, чтобы не загрязнять лабораторный стол и используемое оборудование протеиназой К. В правильно выбранной агарозе эффективными будут если не все, то большинство рестриктаз. Когда рестриктазы не активны в агарозе, они, как правило, не проявляют активность и в растворе. Обычно мы используем соотношение фермент: ДНК, равное 20: 1. В большинстве случаев это соответствует по крайней мере 10-кратному превышению над реально необходимым количеством фермента. Наш опыт, основанный на использовании ДНК и рестриктаз из различных источников, а также опыт других исследователей подсказывает, что именно такой подход гарантирует полноту рестрикции. В случае низкой концентрации ДНК, особенно при работе с бактериями, может оказаться необходимым повысить концентрацию рестриктаз. Для частичного рестриктазного гидролиза необходимо титровать отдельные рестриктазы, добавляя различное их количество к вставкам с образцами ДНК и инкубируя в течение 2,5 ч.

Это интересно:

Витамин B12
Витамин B12 (цианкобаламин), содержит кобальт. В организме человека и животных не образуется, синтезируется микрофлорой кишечника, а затем всасывается в кровь. Обычно запасов витамина в печени человека вполне достаточно, чтобы предохранит ...

Сформулируйте основные законы классической механики материальной точки. Как моделируется система, состоящая из двух и более материальных точек? Приведите примеры задач, в которых можно считать Землю
Первый закон утверждает, что в отсутствии сил тела не меняют своего движения, т.е. при отсутствии дейст­вующих на тело сил существует система отсчета, где это тело покоится. Если оно покоится в одной системе отсчета, то существует множест ...

Адаптация рецепторов
Постоянно действующий стимул лишь в редких случаях создает в рецепторах постоянный уровень возбуждения на неопределенный срок. Чаще при длительном раздражении возбуждение слабеет в большей или меньшей степени. Это явление называется адапт ...