Для ферментативной обработки ДНК, содержащейся в блок-вставке, необходимо предварительно инактивировать протеинкиназу К, оставшуюся после приготовления образца, и убрать диализом ЭДТА и детергенты. Протеиназа К весьма устойчивый фермент и может оставаться активной в растворе ESP при 4°С по крайней мере 1 год. Однако она полностью инактивируется при обработке фенилметилсульфонилфторидом, который крайне нестабилен и свежий раствор, которого поэтому надо добавлять ежедневно. Любая остающаяся во вставке протеиназа К разрушит вносимые ферменты. Необходима чрезвычайная аккуратность, чтобы не загрязнять лабораторный стол и используемое оборудование протеиназой К. В правильно выбранной агарозе эффективными будут если не все, то большинство рестриктаз. Когда рестриктазы не активны в агарозе, они, как правило, не проявляют активность и в растворе. Обычно мы используем соотношение фермент: ДНК, равное 20: 1. В большинстве случаев это соответствует по крайней мере 10-кратному превышению над реально необходимым количеством фермента. Наш опыт, основанный на использовании ДНК и рестриктаз из различных источников, а также опыт других исследователей подсказывает, что именно такой подход гарантирует полноту рестрикции. В случае низкой концентрации ДНК, особенно при работе с бактериями, может оказаться необходимым повысить концентрацию рестриктаз. Для частичного рестриктазного гидролиза необходимо титровать отдельные рестриктазы, добавляя различное их количество к вставкам с образцами ДНК и инкубируя в течение 2,5 ч.

Это интересно:

Работа с агарозными блок-вставками, содержащими образцы ДНК
Для многих целей удобнее и проще иметь дело с ДНК, заключенными в агарозный гель, чем находящимися в растворе. Низкомолекулярные компоненты свободно диффундируют через агарозу при мягком перемешивании. Мы работали с 100 мкл-агарозными бло ...

Определение содержания ДК в плазме крови и гомогенате печени
За основу взят классический метод Гаврилова В.Б. и соавт [9], Владимирова Ю.А. и соавт. [7]. 0,4 мл плазмы вносят в пробирку с плотной крышкой и добавляют 4 мл чисто перегнанной смеси изопропанол : гептан (1:1). Смесь встряхивают в течени ...

Анаэробные пути ресинтеза АТФ
Анаэробные пути ресинтеза АТФ являются дополнительными способами образования АТФ в тех случаях, когда основной путь получения АТФ - аэробный - не может обеспечить мышечную деятельность необходимым количеством энергии. Это бывает на первых ...