Ферментативная обработка

Для ферментативной обработки ДНК, содержащейся в блок-вставке, необходимо предварительно инактивировать протеинкиназу К, оставшуюся после приготовления образца, и убрать диализом ЭДТА и детергенты. Протеиназа К весьма устойчивый фермент и может оставаться активной в растворе ESP при 4°С по крайней мере 1 год. Однако она полностью инактивируется при обработке фенилметилсульфонилфторидом, который крайне нестабилен и свежий раствор, которого поэтому надо добавлять ежедневно. Любая остающаяся во вставке протеиназа К разрушит вносимые ферменты. Необходима чрезвычайная аккуратность, чтобы не загрязнять лабораторный стол и используемое оборудование протеиназой К. В правильно выбранной агарозе эффективными будут если не все, то большинство рестриктаз. Когда рестриктазы не активны в агарозе, они, как правило, не проявляют активность и в растворе. Обычно мы используем соотношение фермент: ДНК, равное 20: 1. В большинстве случаев это соответствует по крайней мере 10-кратному превышению над реально необходимым количеством фермента. Наш опыт, основанный на использовании ДНК и рестриктаз из различных источников, а также опыт других исследователей подсказывает, что именно такой подход гарантирует полноту рестрикции. В случае низкой концентрации ДНК, особенно при работе с бактериями, может оказаться необходимым повысить концентрацию рестриктаз. Для частичного рестриктазного гидролиза необходимо титровать отдельные рестриктазы, добавляя различное их количество к вставкам с образцами ДНК и инкубируя в течение 2,5 ч.


Это интересно:

Развитие слепоты после закрытия век
Когда веки одного глаза были сшиты вместе на протяжении первых двух недель жизни, обезьяны и котята продолжали развиваться нормально и использовали неоперированный глаз. Через 1—3 месяца, однако, когда открывался оперированный глаз, а нор ...

Проведение иммунодиффузии
Расплавляют агар (1,5 г) на водяной бане в 100 мл одного из предлагаемых растворителей (0,15 М раствор Na Cl, веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1). Горячий агарозный гель разливают по 3 мл на предметные стекла, расположенн ...

Деление клетки
В отдельных частях тела растительного организма находятся группы клеток, которые способны делиться. Благодаря этому увеличивается число клеток, они растут, вследствие чего растет весь организм. Рост в течение всей жизни — отличительная ос ...