Ферментативная обработка

Для ферментативной обработки ДНК, содержащейся в блок-вставке, необходимо предварительно инактивировать протеинкиназу К, оставшуюся после приготовления образца, и убрать диализом ЭДТА и детергенты. Протеиназа К весьма устойчивый фермент и может оставаться активной в растворе ESP при 4°С по крайней мере 1 год. Однако она полностью инактивируется при обработке фенилметилсульфонилфторидом, который крайне нестабилен и свежий раствор, которого поэтому надо добавлять ежедневно. Любая остающаяся во вставке протеиназа К разрушит вносимые ферменты. Необходима чрезвычайная аккуратность, чтобы не загрязнять лабораторный стол и используемое оборудование протеиназой К. В правильно выбранной агарозе эффективными будут если не все, то большинство рестриктаз. Когда рестриктазы не активны в агарозе, они, как правило, не проявляют активность и в растворе. Обычно мы используем соотношение фермент: ДНК, равное 20: 1. В большинстве случаев это соответствует по крайней мере 10-кратному превышению над реально необходимым количеством фермента. Наш опыт, основанный на использовании ДНК и рестриктаз из различных источников, а также опыт других исследователей подсказывает, что именно такой подход гарантирует полноту рестрикции. В случае низкой концентрации ДНК, особенно при работе с бактериями, может оказаться необходимым повысить концентрацию рестриктаз. Для частичного рестриктазного гидролиза необходимо титровать отдельные рестриктазы, добавляя различное их количество к вставкам с образцами ДНК и инкубируя в течение 2,5 ч.


Это интересно:

Основные функции крови в организме рыб
Кровь - это жидкая подвижная ткань, циркулирующая в кровеносных сосудах и важнейшая часть внутренней среды организма, выполняющая многообразные физиологические функции: - питательную (трофическую) - при движении крови происходит перенос ...

Семейство Медвежьи. Панда
Большая панда или бамбуковый медведь — млекопитающее, в настоящее время относимое к семейству медведей, родиной которого является центральный Китай. Большая панда живёт в горных регионах, таких как Сычуань и Тибет. Со второй половины XX в ...

Газообмен у птиц
Сверху - парабронх, снизу - капилляр, направление тока воздуха и крови указаны стрелками. Красными и синими кружками обозначены соответственно: кислород и углекислота. При контакте воздуха и крови через аэрогематический барьер концентраци ...