Для ферментативной обработки ДНК, содержащейся в блок-вставке, необходимо предварительно инактивировать протеинкиназу К, оставшуюся после приготовления образца, и убрать диализом ЭДТА и детергенты. Протеиназа К весьма устойчивый фермент и может оставаться активной в растворе ESP при 4°С по крайней мере 1 год. Однако она полностью инактивируется при обработке фенилметилсульфонилфторидом, который крайне нестабилен и свежий раствор, которого поэтому надо добавлять ежедневно. Любая остающаяся во вставке протеиназа К разрушит вносимые ферменты. Необходима чрезвычайная аккуратность, чтобы не загрязнять лабораторный стол и используемое оборудование протеиназой К. В правильно выбранной агарозе эффективными будут если не все, то большинство рестриктаз. Когда рестриктазы не активны в агарозе, они, как правило, не проявляют активность и в растворе. Обычно мы используем соотношение фермент: ДНК, равное 20: 1. В большинстве случаев это соответствует по крайней мере 10-кратному превышению над реально необходимым количеством фермента. Наш опыт, основанный на использовании ДНК и рестриктаз из различных источников, а также опыт других исследователей подсказывает, что именно такой подход гарантирует полноту рестрикции. В случае низкой концентрации ДНК, особенно при работе с бактериями, может оказаться необходимым повысить концентрацию рестриктаз. Для частичного рестриктазного гидролиза необходимо титровать отдельные рестриктазы, добавляя различное их количество к вставкам с образцами ДНК и инкубируя в течение 2,5 ч.

Это интересно:

Сердечно-сосудистая система
Сердце у птиц четырехкамерное, большой и малый круги кровообращения полностью разделены. Масса сердца у разных видов составляет различный процент от массы тела, при чем масса сердца больше у птиц, в жизни которых преобладает полет и котор ...

Отряд парнокопытные. Благородный олень
Благородный олень живет во многих местах мира. Ареал достаточно велик. Это животное можно встретить по всей территории Западной Европы, в Алжире и Марокко, в Южной Скандинавии, Афганистане, Монголии, Тибете, в Юго-Восточном Китае. На терр ...

Витамин B17
Витамин B17 (нитрилозид). Улучшает в организме обменные процессы, препятствует развитию опухолей. Наиболее богаты им семена абрикоса, вишни, миндаля, сливы, яблони, гречихи, проса и льна-долгунца. ...