Общее описание методов. РНКазное расщепление

Единичные нуклеотндные замены во фрагментах геномной ДНК можно обнаружить при расщеплении неспаренных участков в РНК-ДНК-дуплексах, обрабатывая эти дуплексы РНКазой А.Рис. 1 иллюстрирует последовательные этапы процедуры.

1. Синтез равномерно меченного одноцепочечного РНК-зонда с использованием транскрипции in vitro клонированного фрагмента ДНК.

2. Гибридизация зонда с комплементарными последовательностями геномных ДНК – Если в гибриднзуемой ДНК имеется замена нуклеотида, образующие РНК–ДНК-дуплексы содержат однонуклеотндные неспаренные участки.

3. Обработка дуплекса РНКазой А, приводящая к расщеплению цепи РНК по многим, хотя и не по всем, неспаренным нуклеотидам.

4. Анализ меченых фрагментов РНК при помощи денатурирующего гель-электрофореза с последующей радиоавтографией. В этом случае эффективное расщепление по неспаренным основаниям приводит к появлению на радиоавтографах двух меченых фрагментов РНК, размеры которых указывают на положение нуклеотидной замены относительно концов фрагмента ДНК. Одиночный меченый фрагмент РНК, равный по длине фрагменту ДНК, наблюдается в том случае, если в последнем нет нуклеотидных замен или если существующие замены препятствуют расщеплению РНК–ДНК-Дуплекса РНКазой.

На рис. 2 в качестве примера представлены результаты реакций РНКазного расщепления. При такой обработке расщепляется примерно 30–40% от общего числа неспаренных участков в РНК–ДНК-дуплексе. Тестирование фрагмента ДНК в двух независимых реакциях РНКазного расщепления с двумя зондами, комплементарными каждой из его цепей, позволяет выявить в нем 60–70%: всех возможных замен нуклеотидов, так как в этом случае обнаруживаются даже комплементарные замены в обеих цепях.

Оптимальными, на наш взгляд, являются РНК-зонды и соответственно исследуемые на однонуклеотидные замены участки ДНК длиной от 100 до 1000 нуклеотидов. В этом случае и сам зонд, и продукты его расщепления легко выявляются при помощи денатурирующего гель-электрофореза в полиакриламидном геле, аналогичном используемому при секвенировании ДНК. При этом отношение сигнала к фону достаточно высоко для получения четких результатов. Совсем нетрудно наработать меченые одноцепочечные РНК-зонды гораздо большей длины, но результаты обработки таких длинных цепей РНКазой неоднозначны. Еще одна проблема, которая возникает при использовании зондов с длиной цепи более 1000 п.и., заключается в том, что под действием РНКазы наряду с расщеплением РНК–ДНК-дуплексов по неспаренным участкам может происходить расщепление цепи РНК по комплементарно спаренным участкам дуплекса. Кроме того, анализ продуктов расщепления длинных РНК-зондов требует проведения денатурирующего электрофореза в агарозном геле. При этом в ряде случаев не удается полностью разделить гибриды РШ–ДШ и результаты получаются противоречивыми, так как фрагменты РНК, полученные при расщеплении ее по неспаренным участкам, но оставшиеся связанными с ДНК, обнаруживаются в геле в зонах, соответствующих длине всего зонда. Для более эффективного выявления единичных нуклеотидных замен путем РНКазного расщепления мы использовали по несколько зондов в каждой реакции отжига / расщепления. Однако полученные таким способом результаты зачастую очень неоднозначны и с трудом поддаются интерпретации. В силу перечисленных причин при исследовании фрагментов ДНК на единичные замены мы бы рекомендовали использовать в реакциях РНКазного расщепления РНК-зонды длиной от 100 до 1000 нуклеотидов.

Показано, что рибонуклеаза может расщеплять неспаренные участки и в дуплексах РНК–РНК. По данным Перучо, единичные мутации в H-ras-гене выявляются при расщеплении неспаренных участков дуплекса РНК–РНК, образованного мРНК гена H-ras и его «антисмысловой» мРНК. Наши исследования показали, что естественные мутации в гене р-глобина и искусственные мутации в промоторном участке гена р-интерферона можно обнаружить при РНКазном расщеплении как РНК – ДНК-, так и РНК–РНК-дуплексов. На клонированной ДНК-матрице мы получали равномерно меченные одноцепочечные зонды «антисмысловой РНК», ренатурировали их с комплементарной мРНК, обрабатывали образовавшиеся дуплексы РНКазой, а затем идентифицировали продукты расщепления денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле. Поэтому приведенные ниже методики для исследования образцов ДНК с равным успехом могут использоваться и при работе с РНК.


Это интересно:

Характеристика крови производителей линя, выращенных в условиях УЗВ
Морфофизиологические показатели, исследованных производителей линей представлены в таблице 5 и на рисунке 5. Таблица 5 – Морфофизиологические показатели производителей линя Показатель Самцы Самки M ± m CV, % M ± m ...

Постэмбриональное развитие семги
(Постэмбриогенез семги по Н.Ф. Никифорову) I Этап - этап ранней личинки. Продолжительность этапа в условиях севера-20-25 суток. Характеризуется наличием желточного мешка, плавниковой каймы и личиночных органов дыхания. Средний вес 32 мм, ...

Получение персистентно инфицированных клеточных культур
Персистентной инфекции культур клеток при полном отсутствии ЦПД или минимальном его проявлении можно добиться несколькими способами. Одним из них является пассирование вируса с высокой множественностью инфекции и пересев выживающих клеток ...