Материалы. Реактивы для получения РНК-зондовСтраница 2
б) инкубируйте при 37°–50°С в течение ночи;
в) экстрагируйте 3–4 раза фенолом и диализуйте в течение ночи против нескольких литров ТЕ;
г) доведите концентрацию до 5 мг/мл и храните в аликвотах при –70°С.
4.1.2 Реактивы для отжига, расщепления и анализа гелей
Для отжига, реакций расщепления и анализа гелей в процессе РНКазного расщепления требуются следующие реактивы:
1. Тестируемая ДНК – Тестировать можно геномную или клонированную ДНК, амплифицированную в ПЦР, просто клонированную и неамплифицированную геномную ДНК – Получение ДНК в ПЦР описано в разд. 4. Клонированную и неамплифицированную геномную ДНК следует предварительно обработать рестриктазами для последующего количественного учета, а также для достижения максимально эффективной денатурации и реассоциации с зондом. Обработайте ДНК рестриктазами, выщепляющими тестируемый фрагмент, удалите ферменты фенольной экстракцией, сконцентрируйте ДНК, осадив ее этанолом. Ресуспендируйте в ТЕ-буфере в концентрации 100 мкг/мл.
2. Буфер для гибридизации. Для приготовления 10 мл необходимо: 80% формамида 8 мл деионизованного формамида 50 мм PIPES буфера, 1 мл 0,5 М PIPES, рН 6,4 рН
Не автоклавируйте Примечание: приобретайте формамид высокого качества и деионизируйте, осторожно перемешивая с ионообменной смолой Dowex AG50W или ее аналогами в течение 30 мин при комнатной температуре. Используйте примерно 2 г смолы на 100 мл формамида. Соберите формамид, профильтровав его через ватмановскую бумагу 1 ММ и храните в плотно закрытых пробирках при –20°С или –70°С.
Некоторые партии формамида содержат примеси, разрушающие РНК, особенно при высоких температурах. Это приводит к появлению на радиоавтографах высокого фона продуктов реакции РНКазного расщепления. Если остро встает проблема с фоном, рекомендуем перекристаллизовывать формамид перед использованием.
Это интересно:
Понятие возраста человека. Типы возраста:
абсолютный, биологический, паспортный, психический, социальный. Критерии
биологического возраста
Для начала следует упомянуть о различных видах социальных ролей: основанные на личном достижении – достигнутые, и роли унаследованные, или приписанные.
Возрастным статусом (ребенка, подростка, взрослого гражданина ) называется положение ...
Нарушения гомеостаза, вызванные гипоксией и механизмы его восстановления
Известно, что при гипоксии недостаток кислорода приводит к восстановлению переносчиков дыхательной цепи [1]. Восстановление переносчиков I и III комплексов цепи, приводит к увеличению образования АФК, которые активируют свободнорадикальны ...
Критические периоды
онтогенеза
В процессе индивидуального развития имеются критические периоды, когда повышена чувствительность развивающегося организма к воздействию повреждающих факторов внешней и внутренней среды. Выделяют несколько критических периодов развития. Та ...