Материалы. Реактивы для получения РНК-зондов
Страница 2

б) инкубируйте при 37°–50°С в течение ночи;

в) экстрагируйте 3–4 раза фенолом и диализуйте в течение ночи против нескольких литров ТЕ;

г) доведите концентрацию до 5 мг/мл и храните в аликвотах при –70°С.

4.1.2 Реактивы для отжига, расщепления и анализа гелей

Для отжига, реакций расщепления и анализа гелей в процессе РНКазного расщепления требуются следующие реактивы:

1. Тестируемая ДНК – Тестировать можно геномную или клонированную ДНК, амплифицированную в ПЦР, просто клонированную и неамплифицированную геномную ДНК – Получение ДНК в ПЦР описано в разд. 4. Клонированную и неамплифицированную геномную ДНК следует предварительно обработать рестриктазами для последующего количественного учета, а также для достижения максимально эффективной денатурации и реассоциации с зондом. Обработайте ДНК рестриктазами, выщепляющими тестируемый фрагмент, удалите ферменты фенольной экстракцией, сконцентрируйте ДНК, осадив ее этанолом. Ресуспендируйте в ТЕ-буфере в концентрации 100 мкг/мл.

2. Буфер для гибридизации. Для приготовления 10 мл необходимо: 80% формамида 8 мл деионизованного формамида 50 мм PIPES буфера, 1 мл 0,5 М PIPES, рН 6,4 рН

Не автоклавируйте Примечание: приобретайте формамид высокого качества и деионизируйте, осторожно перемешивая с ионообменной смолой Dowex AG50W или ее аналогами в течение 30 мин при комнатной температуре. Используйте примерно 2 г смолы на 100 мл формамида. Соберите формамид, профильтровав его через ватмановскую бумагу 1 ММ и храните в плотно закрытых пробирках при –20°С или –70°С.

Некоторые партии формамида содержат примеси, разрушающие РНК, особенно при высоких температурах. Это приводит к появлению на радиоавтографах высокого фона продуктов реакции РНКазного расщепления. Если остро встает проблема с фоном, рекомендуем перекристаллизовывать формамид перед использованием.

Страницы: 1 2 


Это интересно:

Изображения фиксированных препаратов
В результате исследования метода изучения морфологии и строения клеток методом микроскопии были исследованы 3 фиксированных препарата. 1. Эвглена Зелёная 2. Плесень Мукор 3. Бактериальная клетка Получены следующие изображения: ...

Рефлекторная теория поведения
Рефлекс — основная форма деятельности нервной системы. Наиболее простые рефлексы относятся к врожденным, или безусловным; они передаются по наследству и обеспечивают приспособление организма к постоянным условиям среды. Безусловные рефлек ...

Порядок осциллаториальные – oscillatoriales
Порядок объединяет нитчатые гомоцитные формы. Представителем может служить род осциллатория. Его виды часто образуют сине-зеленые пленки, покрывающие влажную землю, подводные предметы, или плавают в виде толстых кожистых лепешек на поверх ...