Материалы. Реактивы для получения РНК-зондов
Страница 2

б) инкубируйте при 37°–50°С в течение ночи;

в) экстрагируйте 3–4 раза фенолом и диализуйте в течение ночи против нескольких литров ТЕ;

г) доведите концентрацию до 5 мг/мл и храните в аликвотах при –70°С.

4.1.2 Реактивы для отжига, расщепления и анализа гелей

Для отжига, реакций расщепления и анализа гелей в процессе РНКазного расщепления требуются следующие реактивы:

1. Тестируемая ДНК – Тестировать можно геномную или клонированную ДНК, амплифицированную в ПЦР, просто клонированную и неамплифицированную геномную ДНК – Получение ДНК в ПЦР описано в разд. 4. Клонированную и неамплифицированную геномную ДНК следует предварительно обработать рестриктазами для последующего количественного учета, а также для достижения максимально эффективной денатурации и реассоциации с зондом. Обработайте ДНК рестриктазами, выщепляющими тестируемый фрагмент, удалите ферменты фенольной экстракцией, сконцентрируйте ДНК, осадив ее этанолом. Ресуспендируйте в ТЕ-буфере в концентрации 100 мкг/мл.

2. Буфер для гибридизации. Для приготовления 10 мл необходимо: 80% формамида 8 мл деионизованного формамида 50 мм PIPES буфера, 1 мл 0,5 М PIPES, рН 6,4 рН

Не автоклавируйте Примечание: приобретайте формамид высокого качества и деионизируйте, осторожно перемешивая с ионообменной смолой Dowex AG50W или ее аналогами в течение 30 мин при комнатной температуре. Используйте примерно 2 г смолы на 100 мл формамида. Соберите формамид, профильтровав его через ватмановскую бумагу 1 ММ и храните в плотно закрытых пробирках при –20°С или –70°С.

Некоторые партии формамида содержат примеси, разрушающие РНК, особенно при высоких температурах. Это приводит к появлению на радиоавтографах высокого фона продуктов реакции РНКазного расщепления. Если остро встает проблема с фоном, рекомендуем перекристаллизовывать формамид перед использованием.

Страницы: 1 2 


Это интересно:

Ингибин
Ингибин является пептидом с молекулярной массой 23000 дальтон. У женщин гормон обнаруживается в фолликулярной жидкости, а у мужчин синтезируется в семенных канальцах яичек. Ингибин селективно ингибирует освобождение ФСГ из передней доли г ...

Метод определения активности каталазы
Активность каталазы выражается каталазным числом – количеством мг перекиси водорода, которое может разложить 1 мкг крови (гомогената). В две колбы наливали по 7 мл дистиллированной воды и добавляли в них по 1 мл гомогената. Содержимое ко ...

Влияние на образование гормонов
Экстремальные температуры окружающей среды влияют на деятельность эндокринных желез. Так. при повторяющихся воздействиях высокие температуры воздуха снижают секрецию гормона роста, тормозят функцию щитовидной железы и выделение глюкокорти ...