б) инкубируйте при 37°–50°С в течение ночи;

в) экстрагируйте 3–4 раза фенолом и диализуйте в течение ночи против нескольких литров ТЕ;

г) доведите концентрацию до 5 мг/мл и храните в аликвотах при –70°С.

4.1.2 Реактивы для отжига, расщепления и анализа гелей

Для отжига, реакций расщепления и анализа гелей в процессе РНКазного расщепления требуются следующие реактивы:

1. Тестируемая ДНК – Тестировать можно геномную или клонированную ДНК, амплифицированную в ПЦР, просто клонированную и неамплифицированную геномную ДНК – Получение ДНК в ПЦР описано в разд. 4. Клонированную и неамплифицированную геномную ДНК следует предварительно обработать рестриктазами для последующего количественного учета, а также для достижения максимально эффективной денатурации и реассоциации с зондом. Обработайте ДНК рестриктазами, выщепляющими тестируемый фрагмент, удалите ферменты фенольной экстракцией, сконцентрируйте ДНК, осадив ее этанолом. Ресуспендируйте в ТЕ-буфере в концентрации 100 мкг/мл.

2. Буфер для гибридизации. Для приготовления 10 мл необходимо: 80% формамида 8 мл деионизованного формамида 50 мм PIPES буфера, 1 мл 0,5 М PIPES, рН 6,4 рН

Не автоклавируйте Примечание: приобретайте формамид высокого качества и деионизируйте, осторожно перемешивая с ионообменной смолой Dowex AG50W или ее аналогами в течение 30 мин при комнатной температуре. Используйте примерно 2 г смолы на 100 мл формамида. Соберите формамид, профильтровав его через ватмановскую бумагу 1 ММ и храните в плотно закрытых пробирках при –20°С или –70°С.

Некоторые партии формамида содержат примеси, разрушающие РНК, особенно при высоких температурах. Это приводит к появлению на радиоавтографах высокого фона продуктов реакции РНКазного расщепления. Если остро встает проблема с фоном, рекомендуем перекристаллизовывать формамид перед использованием.

Это интересно:

Естествознание в изменяющемся мире
Многочисленные товары массового потребления - от простейших предметов домашнего обихода до современных персональных компьютеров, сложнейшие технические средства эксперимента: мощные лазерные установки, синхрофазотроны, устройства для набл ...

Происхождение клеток и индукционные взаимодействия в простых нервных системах
Происхождение клеток наиболее хорошо исследовано на примере простых беспозвоночных, таких как пиявка, кузнечик, плодовая муха и маленькая нематода Caenorhabditis elegans. В этих препаратах возможно проследить развитие каждой клетки и иссл ...

Действие низкочастотной вибрации на клетки и ткани организма
Физическая природа звука и вибрации одна и та же. В обоих случаях речь идет об упругих колебаниях, волнообразно распространяющихся в среде газообразной, жидкой и твердой. Вместе с тем, как мы уже отмечали, биологический эффект действия зв ...