Материалы. Реактивы для получения РНК-зондовСтраница 2
б) инкубируйте при 37°–50°С в течение ночи;
в) экстрагируйте 3–4 раза фенолом и диализуйте в течение ночи против нескольких литров ТЕ;
г) доведите концентрацию до 5 мг/мл и храните в аликвотах при –70°С.
4.1.2 Реактивы для отжига, расщепления и анализа гелей
Для отжига, реакций расщепления и анализа гелей в процессе РНКазного расщепления требуются следующие реактивы:
1. Тестируемая ДНК – Тестировать можно геномную или клонированную ДНК, амплифицированную в ПЦР, просто клонированную и неамплифицированную геномную ДНК – Получение ДНК в ПЦР описано в разд. 4. Клонированную и неамплифицированную геномную ДНК следует предварительно обработать рестриктазами для последующего количественного учета, а также для достижения максимально эффективной денатурации и реассоциации с зондом. Обработайте ДНК рестриктазами, выщепляющими тестируемый фрагмент, удалите ферменты фенольной экстракцией, сконцентрируйте ДНК, осадив ее этанолом. Ресуспендируйте в ТЕ-буфере в концентрации 100 мкг/мл.
2. Буфер для гибридизации. Для приготовления 10 мл необходимо: 80% формамида 8 мл деионизованного формамида 50 мм PIPES буфера, 1 мл 0,5 М PIPES, рН 6,4 рН
Не автоклавируйте Примечание: приобретайте формамид высокого качества и деионизируйте, осторожно перемешивая с ионообменной смолой Dowex AG50W или ее аналогами в течение 30 мин при комнатной температуре. Используйте примерно 2 г смолы на 100 мл формамида. Соберите формамид, профильтровав его через ватмановскую бумагу 1 ММ и храните в плотно закрытых пробирках при –20°С или –70°С.
Некоторые партии формамида содержат примеси, разрушающие РНК, особенно при высоких температурах. Это приводит к появлению на радиоавтографах высокого фона продуктов реакции РНКазного расщепления. Если остро встает проблема с фоном, рекомендуем перекристаллизовывать формамид перед использованием.
Это интересно:
Классификация, морфологические особенности и биологические особенности
шампиньона
Шампиньоны - деликатесный продукт питания. Эти грибы замечательны не только приятным вкусом, но и ни с чем не сравнимым ароматом, который сохраняется при кулинарной обработке. По пищевым достоинствам превосходят овощи и даже мясо. Особенн ...
Транспортировка икры,
личинок, молоди и взрослых особей выбранного объекта
Растительноядных рыб перевозят в живорыбных вагонах и автомашинах и чаще всего в полиэтиленовых пакетах авто – и авиатранспортом (рис.4.).
Рис. 4. Полиэтиленовый пакет для перевозки живой рыбы
Посадочный материал укладывают в фанерные ...
Результаты исследования и их обсуждение. Активность
катепсина D в плацентарной ткани в норме и при
хронической внутриутробной гипоксии плода
Результаты исследования показали достоверное повышение активности катепсина D плацентарной ткани при хронической внутриутробной гипоксии плода. Отмечено повышение активности фермента при патологии в 1,8 раз по сравнению с нормой (рис.2). ...