Белки разделяются по их молекулярным массам. Додецилсульфат натрия (SDS), связываясь с заряженными молекулами, компенсирует различия между зарядами белков.

Приготовление проб: в 30 мкл каждой фракции с DEAE-cell колонки добавляли по 15 мкл SLB.

Приготовление SLB:

1) SLB без меркаптоэтанола: 1.4 г SDS + 6 г глицерина + буфер, pH 6.8, без SDS - 7.5 мл, доводили деионизированной водой до 20 мл.

2) SLB для проб: 1 мл SLB без МЭ (1); 45 мкл МЭ; 45 мкл бромфеноловый синий .

Приготовление маркера:

10 мкл маркера (0.1 мг/мл) + 120 мкл SLB (1)

Приготовление кумасси: 600 мг кумасси голубого; 200 мл 96% этанола; 40 мл ледяной уксусной кислоты растворить в 200 мл воды.

Концентрированный буфер для форезной камеры: 7.6 г Tris-HCl + 36 г глицина доводили дистиллированной водой до 800 мл и рН 8.3-8.8. После этого в буфер добавляли 2.5 г додецилсульфата натрия.

Рабочий буфер для форезной камеры: Разводили концентрированный буфер в 5 раз.

Буфер для разделяющего геля: Tris-HCl 1.5 M (9.1 г на 50 мл воды доводили до рН 8.8), затем добавляли 200 мг SDS на 50 мл.

Буфер для концентрирующего геля: Tris-HCl 0.5 М (3 г на 50 мл). После доведения рН до 6.8 добавляли 200 мг SDS на 50 мл.

40% - бис-акриламид (60 мл): акриламид 23.34г.; бис-акриламид 0.64г.

Приготовление гелей: сведения представлены в таблице 2.

Таблица 2. Приготовление гелей для SDS-электрофореза в ПААГ.

П р и м е ч а н и е: TEMED вносится непосредственно перед заливанием геля.

После полимеризации гелей пробы (в т.ч. метчик) кипятили на водяной бане в течение 5 минут и горячими наносили в карманчики геля. Маркер (рабочий) наносили в объеме 1/6 от объема проб.

Электрофорез проводили при силе тока 20 мА на одну пластинку. Когда пробы входили в разделяющий гель, силу тока увеличивали в 2 раза и оставляли до тех пор, пока краска не доходила до конца геля (1.5-2 часа).

Красили кумасси примерно 15 мин. Затем отмывали 7.5 % уксусной кислотой в течение ночи на шейкере. Если было необходимо, окрашивали серебрением (таблица 3).

Таблица 3. Окрашивание серебрением (Silver staining, Shevchenko at al., 1996)

Это интересно:

Росянка круглолистная
На каждом листочке находится до двух сотен волосков. На кончике каждого волоска блестит капелька жидкости. Она похожа на капельку росы. Отсюда и название растения - росянка круглолистная. Это самое настоящее растение-хищник. Блестящие лип ...

Теория катастроф
Поскольку в определенных ситуациях – в точках катастроф – даже незначительные движения могут повлиять на ход развития, очень полезным окажется умение определять, далеко ли от такой точки находится система. Формально для этого следует изуч ...

Развитие и становление биофизики как науки
Развитие и становление биофизики как пограничной науки проходило ряд стадий. Уже на начальных этапах биофизика была тесно связана с идеями и методами физики, химии, физической химии и математики. Проникновение и применение законов физики ...