Определение проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ)

Электрическая часть прибора для измерения проводимости бислойных липидных мембран представляет собой амперметр, измеряющий силу тока при определенной разности потенциалов между электродами. Сила тока зависит от проницаемости (сопротивления) мембраны, разделяющей раствор электролита в кювете. Исходя из этого, можно определить проводимость мембраны (проводимость = 1/ сопротивление).

Проводимость билипидного слоя очень близка к нулю (10-12 пСм) при умеренном напряжении. Абсолютное значение напряжения более 150 мВ «рвет» билипидный слой.

Проводимость отличная от нуля определяется белками, встроенными в билипидный слой.

Проводимость нелинейно зависит от напряжения (в случае БЛМ), поэтому определяется проводимость при различных напряжениях.

Подготовка кювет: до и после работы кюветы отмывали детергентами, затем 10-15 минут споласкивали в струе воды (в стакане). Промывали дистиллятом, протирали спиртом, промывали дистиллятом от спирта. Ставили сушиться. Когда кюветы высыхали, смазывали отверстие в меньшей кювете липидами снаружи и внутри и давали высохнуть. Вставляли меньшую кювету в большую. Наливали в каждую кювету по 1 мл среды.

Среда для БЛМ: 3 M KCl; 20 мМ Tris, pH 7.4.

Приготовление липидов: 20 мкл общих липидов мозга и 26 мкл кардиолипина (Blight et al., 1959). Смесь близка по составу к митохондриальным липидам.

Затем эту смесь сушили аргоном, чтобы испарился хлороформ и метанол.

В пробирку с высушенными липидами добавляли 80 мкл н-декана, чтобы растворить липиды перемешивали.

Работа на приборе: наливали в каждую кювету по 800 мкл буфера; вставляли два электрода в кюветы; включали приборы; наносили липиды на отверстие в меньшей кювете, используя микроскоп. Ждали, пока цветная (полислойная) мембрана станет черной (бислойной).

В одну из кювет (обычно транс-) добавляли необходимое количество белка, а в другую (цис-) такое же количество среды для БЛМ, причем с расчетом, чтобы содержание KCl в обеих кюветах было изоосмотическим.

В случае появления проводимости, ее регистрировали две-три минуты, затем меняли напряжение, и ингибировали проводимость АТФ.


Это интересно:

Перекисное окисление липидов и антиоксидантная система фетоплацентарного комплекса при физиологической беременности и хронической внутриутробной гипоксии плода
При физиологической беременности скорость инициированного окисления липидов повышается примерно в 3 раза. Во время беременности в связи с возрастанием основного обмена и увеличением потребления кислорода в крови происходит ряд значительны ...

Понятие «наука» (сущность, содержание, функции, цели, задачи, критерии выделения)
Наука – исторически сложившаяся форма человеческой деятельности направленная на познание и преобладание эффективной деятельности Наука – это рациональный способ познания мира основанный на эмпирической проверки и математических наук. Су ...

Точные (индивидуальные игры)
Неманипуляционные игры Категория 1. Игры типа И→С. (Локомоционные игры; устанавливаются только непосредственные связи индивида с субстратом игровой активности.)- Манипуляционные игры Категория 2. Игры типа И→O. (Манипуляцио ...