Электрическая часть прибора для измерения проводимости бислойных липидных мембран представляет собой амперметр, измеряющий силу тока при определенной разности потенциалов между электродами. Сила тока зависит от проницаемости (сопротивления) мембраны, разделяющей раствор электролита в кювете. Исходя из этого, можно определить проводимость мембраны (проводимость = 1/ сопротивление).

Проводимость билипидного слоя очень близка к нулю (10-12 пСм) при умеренном напряжении. Абсолютное значение напряжения более 150 мВ «рвет» билипидный слой.

Проводимость отличная от нуля определяется белками, встроенными в билипидный слой.

Проводимость нелинейно зависит от напряжения (в случае БЛМ), поэтому определяется проводимость при различных напряжениях.

Подготовка кювет: до и после работы кюветы отмывали детергентами, затем 10-15 минут споласкивали в струе воды (в стакане). Промывали дистиллятом, протирали спиртом, промывали дистиллятом от спирта. Ставили сушиться. Когда кюветы высыхали, смазывали отверстие в меньшей кювете липидами снаружи и внутри и давали высохнуть. Вставляли меньшую кювету в большую. Наливали в каждую кювету по 1 мл среды.

Среда для БЛМ: 3 M KCl; 20 мМ Tris, pH 7.4.

Приготовление липидов: 20 мкл общих липидов мозга и 26 мкл кардиолипина (Blight et al., 1959). Смесь близка по составу к митохондриальным липидам.

Затем эту смесь сушили аргоном, чтобы испарился хлороформ и метанол.

В пробирку с высушенными липидами добавляли 80 мкл н-декана, чтобы растворить липиды перемешивали.

Работа на приборе: наливали в каждую кювету по 800 мкл буфера; вставляли два электрода в кюветы; включали приборы; наносили липиды на отверстие в меньшей кювете, используя микроскоп. Ждали, пока цветная (полислойная) мембрана станет черной (бислойной).

В одну из кювет (обычно транс-) добавляли необходимое количество белка, а в другую (цис-) такое же количество среды для БЛМ, причем с расчетом, чтобы содержание KCl в обеих кюветах было изоосмотическим.

В случае появления проводимости, ее регистрировали две-три минуты, затем меняли напряжение, и ингибировали проводимость АТФ.

Это интересно:

Риски развития клонированных существ
На чем же основываются опасения ученых и общественности, ратующей за ограничение экспериментов по клонированию живых организмов? В о-первых, существуют опасения вмешательства в ту сферу, о которой знаем еще слишком мало. Выиграя в чем- ...

Зоны относительной мощности мышечной работы
В настоящее время приняты различные классификации мощности мышечной деятельности. Одна из них - классификация по B.C. Фарфелю, базирующаяся на положении о том, что мощность выполняемой физической нагрузки обусловлена соотношением между тр ...

Причины отравления грибами
1.Токсичность самих грибов, обусловленная наличием токсинов (или микотоксинов) 2.Продолжительное хранение собранных грибов без их кулинарной обработки, либо длительное хранение уже приготовленных грибов 3.Поражение грибов вредителями, в ...