Среда выделения (150 мл, рН 7.4): сахароза 70 мМ; маннитол 210 мМ; хепес 10 мМ; ЭГТА 2 мМ. Среду разделяли на три части. В одну (10 мл) добавляли 1 мг протеазы (непосредственно перед выделением). В другую (70 мл) - добавляли 140 мг БСА. В третью (70 мл) ничего не добавляли.

Все процедуры проводили при 4 °С.

Сердце помещали в предварительно охлажденный физраствор и взвешивали. Затем клали сердце в среду с протеазой на 10 минут, измельчая сердце ножницами. Через 10 минут часть жидкости сверху сливали, чтобы удалить частички жира и связки. Далее разводили средой с альбумином в 9 раз и гомогенизировали.

Гомогенат центрифугировали пять минут при 650g (осаждаются ядра и обрывки мембраны).

Супернатант центрифугировали 10 мин при 8000g.

Осадок ресуспендировали в среде без альбумина, центрифугировали 10 минут при 8000g.

Осадок вновь ресуспендировали в среде без альбумина из расчета 0.1 мл среды на 1г ткани сердца и ставили в лед.

Это интересно:

Белок полосы 3 - анионный переносчик из мембраны эритроцитов
На долю белка полосы 3 приходится около 25% общего количества мембранных белков эритроцита человека; сходные белки присутствуют также в неэритроидных клетках. Этот белок выполняет несколько функций, причем их можно соотнести с двумя основ ...

Двойная радиальная иммунодиффузия по Ухтерлони. Принцип
В слое агарового геля равномерной толщины на определенном расстоянии друг от друга вырезают лунки для антигена и антисыворотки и заполняют их соответствующими растворами. После этого антигены и антитела диффундируют в гель, встречаются др ...

Риски развития клонированных существ
На чем же основываются опасения ученых и общественности, ратующей за ограничение экспериментов по клонированию живых организмов? В о-первых, существуют опасения вмешательства в ту сферу, о которой знаем еще слишком мало. Выиграя в чем- ...