Среда выделения (150 мл, рН 7.4): сахароза 70 мМ; маннитол 210 мМ; хепес 10 мМ; ЭГТА 2 мМ. Среду разделяли на три части. В одну (10 мл) добавляли 1 мг протеазы (непосредственно перед выделением). В другую (70 мл) - добавляли 140 мг БСА. В третью (70 мл) ничего не добавляли.

Все процедуры проводили при 4 °С.

Сердце помещали в предварительно охлажденный физраствор и взвешивали. Затем клали сердце в среду с протеазой на 10 минут, измельчая сердце ножницами. Через 10 минут часть жидкости сверху сливали, чтобы удалить частички жира и связки. Далее разводили средой с альбумином в 9 раз и гомогенизировали.

Гомогенат центрифугировали пять минут при 650g (осаждаются ядра и обрывки мембраны).

Супернатант центрифугировали 10 мин при 8000g.

Осадок ресуспендировали в среде без альбумина, центрифугировали 10 минут при 8000g.

Осадок вновь ресуспендировали в среде без альбумина из расчета 0.1 мл среды на 1г ткани сердца и ставили в лед.

Это интересно:

Структура аспартат-трансаминазы
Трансаминазы имеются во всех животных и растительных клетках, а также в микроорганизмах. В настоящее время известно около 60 трансаминаз, различающихся по субстратной специфичности. Из них лучше всего исследована аспартат-трансаминаза, пр ...

Глюкозный сенсор
Для определения глюкозы предложен микробный сенсор, состоящий из иммобилизованных целых клеток Pseudomonas fluorescens и кислородного электрода. Сенсор помещали в исследуемый раствор, который во время измерений насыщали кислородом и перем ...

Размножение
Размножение - важнейший период жизни, который должен наступать тогда, когда сложились максимально благоприятные условия для появления жизнеспособного потомства. Из-за этого птицы приступают к размножению только при наличии ряда факторов, ...