Среда выделения (150 мл, рН 7.4): сахароза 70 мМ; маннитол 210 мМ; хепес 10 мМ; ЭГТА 2 мМ. Среду разделяли на три части. В одну (10 мл) добавляли 1 мг протеазы (непосредственно перед выделением). В другую (70 мл) - добавляли 140 мг БСА. В третью (70 мл) ничего не добавляли.

Все процедуры проводили при 4 °С.

Сердце помещали в предварительно охлажденный физраствор и взвешивали. Затем клали сердце в среду с протеазой на 10 минут, измельчая сердце ножницами. Через 10 минут часть жидкости сверху сливали, чтобы удалить частички жира и связки. Далее разводили средой с альбумином в 9 раз и гомогенизировали.

Гомогенат центрифугировали пять минут при 650g (осаждаются ядра и обрывки мембраны).

Супернатант центрифугировали 10 мин при 8000g.

Осадок ресуспендировали в среде без альбумина, центрифугировали 10 минут при 8000g.

Осадок вновь ресуспендировали в среде без альбумина из расчета 0.1 мл среды на 1г ткани сердца и ставили в лед.

Это интересно:

Катепсины
Катепсины - (от греч. kathepso-перевариваю), ферменты класса гидролаз, катализирующие гидролиз пептидной связи. Содержатся в тканях животных и человека. Неспецифический протеолиз играет важную роль в регуляции белкового обмена, в ходе кот ...

Влияние экологических условий на жизнеспособность мицелия микроскопических грибов
При определении жизнеспособности грибного мицелия разной длины в различных экологических условиях среды, установлено, что увеличение концентрации органического вещества (сахарозы) в интервале 0–20 г/л было благоприятно для фрагментов Muco ...

Змеи поражают добычу вслепую
Известно, что многие виды змей даже будучи лишенными зрения способны поражать свои жертвы со сверхъестественной точностью. Рудиментарность их тепловых сенсоров не дает оснований утверждать, что одна только способность воспринимать тепло ...