Среда выделения (150 мл, рН 7.4): сахароза 70 мМ; маннитол 210 мМ; хепес 10 мМ; ЭГТА 2 мМ. Среду разделяли на три части. В одну (10 мл) добавляли 1 мг протеазы (непосредственно перед выделением). В другую (70 мл) - добавляли 140 мг БСА. В третью (70 мл) ничего не добавляли.

Все процедуры проводили при 4 °С.

Сердце помещали в предварительно охлажденный физраствор и взвешивали. Затем клали сердце в среду с протеазой на 10 минут, измельчая сердце ножницами. Через 10 минут часть жидкости сверху сливали, чтобы удалить частички жира и связки. Далее разводили средой с альбумином в 9 раз и гомогенизировали.

Гомогенат центрифугировали пять минут при 650g (осаждаются ядра и обрывки мембраны).

Супернатант центрифугировали 10 мин при 8000g.

Осадок ресуспендировали в среде без альбумина, центрифугировали 10 минут при 8000g.

Осадок вновь ресуспендировали в среде без альбумина из расчета 0.1 мл среды на 1г ткани сердца и ставили в лед.


Это интересно:

Биосинтез белка
Биосинтез белка — сложный многостадийный процесс синтеза полипептидной цепи из аминокислотных остатков, происходящий на рибосомах клеток живых организмов с участием молекул иРНК и тРНК. Транскрипция Транскрипцией называется процесс счит ...

Околоводные местообитания
Фауна водных и прибрежных птиц разнообразна и обычно характеризуется высокой численностью уток, куликов, чаек и других видов, что определяется высокой кормностью природных объектов. Связь с водой у разных представителей водных и прибрежн ...

Материалы. Реактивы для получения РНК-зондов
Для получения равномерно меченных РНК-зондов необходимы те же реактивы, что и для реакций РНКазного расщепления. Здесь мы приводим условия использования РНК-полиме-раз и промоторов из бактериофагов SP6, Т7 и ТЗ. Более подробную информацию ...