Проведение исследования. Реагенты и приборы

Моноспецифические антисыворотки; стандартные растворы антигенов; рабочий стандарт; веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1; агар; рамки для закрепления предметных стекол, штативы для этих рамок, кюветы для элюции из комплекта для электрофореза; измерительный инструмент с точностью до 0,1 мм; микрошприц.

Нагревают 1,5 г агара до полного расплавления в 100 мл веронал-ацетатного буфера на водяной бане и, охладив до 48°С, смешивают в нужной пропорции с антисывороткой, подогретой до той же температуры. Смесь разливают по 2 мл на предметные стекла, расположенные строго горизонтально. Золь должен равномерно распределиться по поверхности стекла. Чтобы усилить сцепление геля со стеклом, рекомендуется предварительно покрыть стекло тонкой агаровой пленкой.

В пластинке геля вырезают лунки, рассчитанные на 2 мкл антигенного раствора каждая. После внесения антигена пластинки геля помещают во влажную камеру и проводят иммунодиффузию при комнатной температуре. Кольца преципитации можно измерять прямо на влажной пластинке. Если преципитаты видны недостаточно четко, то сначала элюируют непреципитировавшие белки в двух сменах 0,15 М раствора NaCl по 12 ч, затем гель высушивают и окрашивают красителями, например амидо-черным, и высушивают вновь.

Площадь, занимаемая преципитатом к концу диффузии, прямо пропорциональна исходной концентрации антигена в лунке. Для построения калибровочной кривой берут либо площадь преципитата как функцию концентрации антигена, либо логарифм диаметра преципитата как функцию логарифма концентрации антигена:

S=K*QAГ+S0,

где S – площадь преципитата, включая S0, S0 – площадь стартовой лунки и QAГ -- количество антигена.

Наклон К полученной прямой обратно пропорционален концентрации антител в геле. Уменьшив содержание антисыворотки в агаре, можно увеличить К. В результате возрастет диаметр преципитата, что повысит чувствительность и экономность метода. Оптимальная концентрация антисыворотки в геле зависит прежде всего от титра антител.

Результаты иммунодиффузии существенно не зависят от температуры. Опыт может быть поставлен при 4, 20 или 37°С. Следует избегать только резких (более 5°) колебаний температуры.

Необходимая продолжительность иммунодиффузии зависит от природы изучаемого антигена. Первый ориентировочный замер преципитатов можно сделать уже через 24 ч.


Это интересно:

Основная часть. Некоторые исчезающие животные, занесенные в Красную Книгу
Семиреченский тритон, или лягушкозуб (Рис.1). Распространен в Джунгарском Алатау (горный хребет между рекой Или и озером Алаколь). Рис.1. Семиреченский тритон, или лягушкозуб Не велик по размерам семиреченский тритон, его общая длина ...

Происхождение клеток и индукционные взаимодействия в простых нервных системах
Происхождение клеток наиболее хорошо исследовано на примере простых беспозвоночных, таких как пиявка, кузнечик, плодовая муха и маленькая нематода Caenorhabditis elegans. В этих препаратах возможно проследить развитие каждой клетки и иссл ...

Класс гормогониофициевые – hormogoniophyceae
Этот класс объединяет нитчатые многоклеточные синезеленые водоросли, у которых протопласты соседних клеток сообщаются посредством плазмодесм. Такие нити носят специальное название трихом. Размножение – посредством гормогониев, которые обы ...