Методы определения инфекционности

Материалы » Группа пневмовирусов » Методы определения инфекционности

Инфекционность препаратов РСВ можно определить методом бляшек. Метод, описываемый здесь для клеток BS-C-1, пригоден и для работы с большинством других клеточных культур.

1. Высевают по 106 клеток в чашки Петри диаметром 60 мм. Чашки инкубируют в течение ночи при 37 °С и используют клетки сразу же после образования плотного монослоя.

2. Культуральную среду удаляют и вносят в чашки по 0,2 мл последовательных 10-кратных разведений вирусного препарата. Для приготовления разведений можно использовать буферный раствор, например PBS, или, предпочтительно, среду MEM.

В обоих случаях используемый для разведения вируса раствор должен содержать 0,5% ЭТС и антибиотики.

3. Культуру инкубируют 1 ч при 31 °С для адсорбции вируса.

4. В каждую чашку вносят по 5 мл покрытия. Удаление инокулята необязательно. В качестве покрытия можно использовать среду MEM, содержащую 1-2% ЭТС, антибиотики и 0,9% агара. Эту среду готовят, смешивая равные объемы нагретой до 37 °С среды MEM в двойной концентрации и расплавленного 1,8% -ного агара Нобль. При температуре 43-46 °С агар не застывает, и покрытие можно наносить на слой клеток без их повреждения.

5. Клетки инкубируют 3-5 сут. при 31-39°С; время инкубации зависит от температуры: чем выше температура, тем короче время инкубации.

Для приготовления стабильных препаратов, в которых можно подсчитывать бляшки через длительное время после опыта, в каждую чашку добавляют 2 мл 1%-ного раствора глутарового альдегида в PBS и оставляют при комнатной температуре по крайней мере на 4 ч для фиксации. Фиксирующий раствор и агаровое покрытие удаляют и добавляют в чашки раствор подходящего красителя, окрашивают в течение 5 мин, затем тщательно промывают водой и сушат. Для максимально точного подсчета бляшек необходим бинокулярный микроскоп с небольшим увеличением. Для окрашивания можно использовать и 0,01%-ный раствор нейтрального красного в PBS или в среде, содержащей 0,9% агара.

Обычно для усиления контраста из состава агарового покрытия исключают феноловый красный, но это не имеет принципиального значения. Окрашивание раствором нейтрального красного проходит быстрее, однако такие препараты нестабильны и подвержены фотохимическому повреждению под действием света.

Окрашивание с помощью твердого нейтрального красного, входящего в состав агарового покрытия, происходит медленнее, однако в тех случаях, когда необходимо выделить инфекционный вирус из индивидуальных бляшек, данный метод явно предпочтительнее.


Это интересно:

Гемадсорбция
Адсорбция эритроцитов на клетках, зараженных РСВ, не описана. Негативные результаты получены с эритроцитами африканской зеленой мартышки, шимпанзе, обезьяны гелады, морской свинки, крысы, хомячка, мыши, утки, гуся, голубя, курицы и цыплен ...

Очистка РСВ методом изопикнического центрифугирования
Данный метод требует более длительного центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы или метризамида. Растворы метризамида обладают более низкой вязкостью и осмотическим давлением, чем растворы сахарозы, и поэтому их использование д ...

Особенности питания спортсменов
Питание спортсменов имеет ряд особенностей по сравнению с питанием не занимающихся спортом, в том числе людей, выполняющих тяжелую физическую работу. 1. Для спортсменов характерен высокий расход энергии. При занятиях спортом энергозатрат ...