Для кинетической характеристики транспортных систем, которые катализируют облегченную диффузию или активный транспорт, могут использоваться различные подходы к анализу стационарного состояния. Все эти подходы основаны на измерении скорости переноса растворимых веществ через мембрану, но при разных условиях. В качестве примера мы рассмотрим эксперименты, которые проводились на пермеазах и мембранных везикулах. Обычно для такого рода измерений используют радиоактивные метки. Ключевым моментом является то, что пермеаза должна не только переносить вещество через бислой (цис → транс), то также и возвращаться обратно (транс → цис). Скорость транспорта может зависеть от любой из этих стадий. Опишем вкратце некоторые подходы к анализу.

1. Субстрат присутствует только с одной стороны мембраны (цис). Начальная скорость транспорта измеряется для однонаправленного потока. Обратите внимание, что для обеспечения постоянного потока транспортируемого вещества переносчик (пермеаза) должен вернуться свободным. Измеряют поток как функцию [S] цис для процесса, протекающего в любом направлении (например, для переноса вещества внутрь везикул или для выведения его из везикул).

Равновесный обмен. Субстрат присутствует в одинаковой концентрации с обеих сторон мембраны, но радиоактивная метка - только с одной стороны (цис). В этом случае пермеаза может возвращаться, будучи связанной с немеченым веществом. Из меряют поток как функцию [S].

Меченый субстрат находится с цис-стороны мембраны, а в насыщающей концентрации он присутствует на противоположной (транс) стороне. Измеряют поток как функцию [S] цuc. Как и в первом случае, при этом регистрируют однонаправленный поток (цис→ транс). Такой поток называют также встречным, поскольку меченое вещество переносится против своего химического градиента.

Удельная радиоактивность субстрата с обеих сторон мембраны одинакова. В насыщающей концентрации субстрат находится на транс-стороне, a [S] цис изменяется. В этом случае измеряют суммарный перенос, поскольку радиоактивное вещество пересекает мембрану в обоих направлениях. При таких условиях измерения состояние системы близко к равновесному.

Во всех случаях определяют Vmax и Км которые при этом не обязательно совпадают для разных подходов. Для разных моделей можно получить кинетические уравнения для стационарного состояния и проверить их. Как и в классических работах по энзимологии, очень полезным может оказаться использование ингибиторов. При этом ингибиторы можно вводить с любой стороны мембраны, что позволяет получить дополнительную информацию.

Такого рода подходы можно применять при работе с клетками, субклеточными мембранными везикулами или искусственными реконструированными системами. Для исследования работы ионных каналов обычно применяют электрические методы, которые дают огромные преимущества. Их мы рассмотрим в следующем разделе.

Это интересно:

Класс хамесифонофициевые – chamaes1phonophyceae
Сюда относятся эпифитные одноклеточные водоросли, дифференцированные на вершину и основание, которым они прикрепляются к субстрату, а также нитчатые формы, сложенные из изолированных толстостенных клеток. Размножение – посредством эндоспо ...

Очистка матричной РНК для трансляции
Матричную РНК для трансляции in vitro получают следующим образом. 1. 50-Ю6 клеток заражают РСВ. Клетки инкубируют 10-12 ч при 37 °С. 2. Монослой промывают, снимают клетки со стекла и суспендируют в буферном растворе. Суспензию оставляют ...

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез
Два фрагмента ДНК, различающиеся лишь делецией, инсерцией или заменой одного нуклеотида, или единственным неспаренным нуклеотидом, можно легко разделить при помощи денатурирующего градиентного гель-электрофореза, ДГГЭ. Принцип метода закл ...