Радиоиммунопреципитация

Материалы » Группа пневмовирусов » Радиоиммунопреципитация

Радиоиммунопреципитация проводится стандартным методом, описанным, например, Ферни и Герином и Уордом и др. Для РСВ применяют следующую методику.

1. "Монослойные культуры клеток в чашках Петри диаметром 50 мм заражают РСВ с множественностью инфекции более 1 БОЕ/кл. Через определенные промежутки времени после заражения проводят импульсное мечение. Для этого культуральную среду в чашках заменяют на 1 мл PBS, содержащего 30 мкКи - метионина и 25 мкКи - цистеина, и инкубируют чашки при 31 °С 1 ч.

2. Радиоактивный раствор сливают и монослой промывают охлажденным PBS.

3. Клетки снимают со стекла с помощью стерильной резиновой палочки и осаждают центрифугированием.

4. Клетки ресуспендируют в 200 мкл лизирующего буфера, инкубируют суспензию 30 мин в ледяной бане, затем интенсивно перемешивают.

5. Ядра и клеточный дебрис удаляют центрифугированием 5 мин при 10 000 g.

6. Лизат осветляют инкубацией с 50 мкл 10% -ной суспензии фиксированных формалином стафилококков или с 50 мкл суспензии покрытых белком-А гранул 30 мин при 0°С.

7. Стафилококки удаляют центрифугированием. К 50 мкл лизата добавляют 10 мкл гипериммунной сыворотки, перемешивают и инкубируют 3 ч во льду.

8. Добавляют 100 мкл суспензии стафилококков, перемешивают и инкубируют смесь 30 мин при комнатной температуре.

9. Иммунные комплексы осаждают центрифугированием 20 с при 10 000 g.

10. Осадок 3 раза промывают раствором, содержащим 500 мМ LiCl, 100 мМ трис-HCl, рН 8,5.

11. Осадок после промывки ресуспендируют в 50 мкл смеыг для диссоциации, кипятят 2 мин и либо немедленно наносят на гель для электрофореза, либо хранят при - 20 °С.


Это интересно:

Биологические основы кормления исследуемого объекта
На первых этапах постэмбрионального развития предличинки рыб осуществляют свое питание за счет содержимого желточного мешка. При резорбции последнего на 2/3 наступает переход на смешанное питание. После полного рассасывания желточного меш ...

Определение ХС-ЛОНП (холестерина-липопротеидов очень низкой плотности) расчетным методом
Уровень ХС-ЛОНП находят путем деления показателя концентрации триацилглицеринов на 2,2 (ТГ/2,2). Вывод этой формулы расчетов базируется на том, что, во-первых, при отсутствии в крови хиломикронов (а они после 12-часового голодания у больш ...

Хранение вируса
Пневмовирусы следует хранить в интервале температур от -70°С до - 198°С. При - 20°С наступает достаточно быстрая потеря инфекционное™, и в таких условиях вирус нельзя хранить более 3 мес. Лиофилизация или добавление глицерина позволяют ув ...