Локализация и количественное определение вирусных антигенов по связыванию стафилококков

Материалы » Группа пневмовирусов » Локализация и количественное определение вирусных антигенов по связыванию стафилококков

Клетки Staphylococcus aureus с помощью поверхностного А-белка связываются с Fc-фрагментами иммуноглобулинов. Этот эффект можно использовать для исследования пространственной локализации вирусного антигена на плазматической мембране зараженных клеток после их обработки противовирусной сывороткой. Стафилококки более удобны, чем покрытые А-белком шарики латекса, полиметил-метакрилата или полистирола, в связи с легкостью получения бактерий и одинаковым диаметром всех бактериальных клеток (около 1 мкм). На поверхности клеток, зараженных многими вирусами, стафилококки распределяются равномерно, но в случае пневмовирусов они специфически связываются с нитевидными выростами, образование которых является уникальной особенностью зараженных этими вирусами клеток. Связывание стафилококков высокоспецифично и подтверждает результаты иммунофлуоресцентного окрашивания, которые свидетельствуют о том, что вирусные антигены на поверхности зараженных клеток локализованы преимущественно в составе нитевидных структур.

Связывание стафилококков с поверхностью зараженных клеток проводят по следующей методике.

1. Клетки выращивают на покровных стеклах до образования монослоя и заражают вирусом. Лучше всего использовать клетки почки кенгуровой крысы, поскольку они высокочувствительны к пневмовирусам и не имеют поверхностных выростов.

2. Зараженные клетки инкубируют в поддерживающей среде, промывают PBS для полного удаления входящей в состав среды сыворотки, затем фиксируют 10-15 мин 2,5% -ным раствором глутарового альдегида в PBS при комнатной температуре.

3. Клетки обрабатывают противовирусной сывороткой 1 ч при 37 °С.

4. Антисыворотку удаляют, тщательно промывая клетки PBS. К клеткам добавляют суспензию aureus, штамм Cowan, приготовленную по методу Прингла и Парри, или коммерческий препарат стафилококков и инкубируют 5 мин при 37 °С.

5. Несвязавшиеся стафилококки удаляют, быстро промывая стекла PBS, и клетки фиксируют 60 мин при комнатной температуре 2% -ным раствором четырехокиси осмия в PBS. После этого стекла можно подготовить к сканирующей электронной микроскопии и исследовать.

Подсчет числа связавшихся с клетками стафилококков дает возможность количественно исследовать экспрессию вирусных антигенов на клеточной мембране при условии постановки соответствующих контролей.


Это интересно:

Какими бывают чернила
Сохранился очень вкусный древнеримский рецепт чернил: надо взять много винограда… и съесть его! А косточки выплюнуть, сжечь и полученную сажу смешать с маслом. Когда читаешь про старые способы получения чернил, то, кажется, что их сочиня ...

Определение активности аминотрансфераз методом Райтмана – Френкеля
АСТ в присутствии L - кетоглутарата катализирует реакцию переаминирования L - -аспартата с образованием оксалоацетата, который декарбоксилируется до пирувата /41/: L – кетоглутарат + L - аспартат → L – глутамат + оксалоацетат ͛ ...

Материалы. Реактивы для получения РНК-зондов
Для получения равномерно меченных РНК-зондов необходимы те же реактивы, что и для реакций РНКазного расщепления. Здесь мы приводим условия использования РНК-полиме-раз и промоторов из бактериофагов SP6, Т7 и ТЗ. Более подробную информацию ...