1. Зараженные клетки фиксируют, добавляя к монослою, выращенному в чашке Петри диаметром 50 мм, глутаровый. альдегид до концентрации 2,5%.

2. После фиксации в течение 30 мин монослой дважды промывают PBS и добавляют 10 капель 1% -ного раствора четы-рехокиси осмия.

3. Через 15 мин монослой еще 2 раза промывают PBS, снимают клетки со стекла и суспендируют их в 2 мл PBS.

4. Клетки осаждают центрифугированием и дегидратируют, последовательно суспендируя в растворах с возрастающей концентрацией этанола; в каждом растворе клетки инкубируют 5 мин; при необходимости их можно выдержать в течение ночи в 70% -ном этаноле. После инкубации в 90% -ном этаноле клетки дважды по 15 мин обрабатывают 100% -ным этанолом.

5. Этанол заменяют на смесь этанола и окиси пропилена.

6. Через 15 мин смесь этанол-окись пропилена заменяют на свежую, инкубируют суспензию еще 30 мин, после этого ресуспендируют клетки в смеси этанол-окись пропилена-среда EPON, а затем в среде EPON 1 ч.

7. Компактный осадок клеток наносят на небольшой объем среды EPON в капсуле ВЕЕМ и, заполнив капсулу средой EPON, инкубируют их 48 ч при 60 °С для полимеризации. После этого заключенные в капсулу клетки готовы для приготовления срезов стандартным способом на ультрамикротоме.

8. Тонкие срезы располагают на необработанных сеточках для электронной микроскопии и через 24 ч окрашивают 5 мин,, помещая сеточки препаратами вниз в каплю насыщенного раствора уранилацетата в метаноле.

9. Сеточки промывают дистиллированной водой и сушат на листе фильтровальной бумаги.

10. На срез наносят каплю 0,1 М раствора NaOH и помещают сеточку срезом вниз на 5 мин в каплю раствора ацетата свинца. Сеточки промывают и сушат на листе фильтровальной бумаги, после этого они готовы к электронно-микроскопическому исследованию.

Это интересно:

Вирусные белки
Гликопротеин (GP) является единственным поверхностным белком вириона. Его тримеры образуют шипы на поверхности вириона и отвечают, по-видимому, за первичное присоединение вируса к клетке. Этот белок сильно модифицирован (в отличие от боль ...

Причины отравления грибами
1.Токсичность самих грибов, обусловленная наличием токсинов (или микотоксинов) 2.Продолжительное хранение собранных грибов без их кулинарной обработки, либо длительное хранение уже приготовленных грибов 3.Поражение грибов вредителями, в ...

Клонирование и биотехнология в животноводстве
Клонирование - совокупность методов, использующихся для получения клонов. Клонирование многоклеточных организмов включает пересадку ядер соматических клеток в оплодотворенное яйцо с удаленным пронуклеусом. Дж. Гердон (1980) впервые доказа ...