Градиентное центрифугирование

Материалы » Группа пневмовирусов » Градиентное центрифугирование

В литературе можно встретить не одну методику очистки РСВ градиентным центрифугированием. Представленная ниже была успешно использована для очистки штамма А2.

1. Монослой клеток Нер-2 заражают РСВ. Адсорбцию проводят 2 ч при 37°С, затем добавляют культуральную среду.

2. Через 10 ч после заражения добавляют актиномицин D до концентрации 0,3 мкг/мл. Для радиоактивного мечения РНК через 16-20 ч после заражения заменяют культуральную среду на свежую, содержащую 20 мкКи/мл - уридина. Для введения метки в белки в среду добавляют 5 мкКи/мл - метионина.

3. При проявлении ЦПД и образовании синцитиев собирают культуральную жидкость. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием 20 мин при 11000 g и концентрируют вирус центрифугированием 90 мин при 65000 g на холоду.

4. Осадок ресуспендируют в буфере NTE при ультразвуковой обработке.

5. Вирус центрифугируют 1 ч при 150 000 g в 10-50% -ном градиенте концентрации сахарозы и собирают фракции, содержащие видимую зону вируса.

6. Содержащие вирус фракции объединяют, разводят NTE и обрабатывают ультразвуком. Вирус вновь центрифугируют 2 ч при 150 000 g в 20-60% -ном градиенте концентрации сахарозы.

7. Вирус концентрируют повторным центрифугированием 90 мин при 65000 g.

Данная методика позволяет получить частично очищенные препараты радиоактивно меченного РСВ. Для последующей очистки предложены более сложные методы; инфекционность, которая в обычных условиях очень чувствительна к центрифугированию, можно стабилизировать добавлением MgS04 до концентрации 1 М.


Это интересно:

Концентрирование вируса
Предложен простой метод концентрирования РСВ преципитацией полиэтиленгликолем. 1. Готовят 36% -ный раствор ПЭГ 6000 в дистиллированной воде. 2. Раствор охлаждают и добавляют к содержащей вирус жидкости до конечной концентрации ПЭГ 6%. ...

Глаз и зрение
В познании внешнего мира зрение играет первостепенную роль: через зрительный анализатор человек получает основное количество информации. Орган зрения человека — глаз. Брови, веки, ресницы, слезы служат для защиты глаз от повреждений. Гла ...

Наблюдения
У птенцов клюв очерчен белым, внутри рот жёлтый. 26.07. – Белый окрас оперения под крыльями и под хвостом у птенцов. Красного оперения нет как у взрослых птиц на шее, на лбу и у самца под … Птенцы подают голосовые сигналы, сами чистятся. ...