Градиентное центрифугирование

Материалы » Группа пневмовирусов » Градиентное центрифугирование

В литературе можно встретить не одну методику очистки РСВ градиентным центрифугированием. Представленная ниже была успешно использована для очистки штамма А2.

1. Монослой клеток Нер-2 заражают РСВ. Адсорбцию проводят 2 ч при 37°С, затем добавляют культуральную среду.

2. Через 10 ч после заражения добавляют актиномицин D до концентрации 0,3 мкг/мл. Для радиоактивного мечения РНК через 16-20 ч после заражения заменяют культуральную среду на свежую, содержащую 20 мкКи/мл - уридина. Для введения метки в белки в среду добавляют 5 мкКи/мл - метионина.

3. При проявлении ЦПД и образовании синцитиев собирают культуральную жидкость. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием 20 мин при 11000 g и концентрируют вирус центрифугированием 90 мин при 65000 g на холоду.

4. Осадок ресуспендируют в буфере NTE при ультразвуковой обработке.

5. Вирус центрифугируют 1 ч при 150 000 g в 10-50% -ном градиенте концентрации сахарозы и собирают фракции, содержащие видимую зону вируса.

6. Содержащие вирус фракции объединяют, разводят NTE и обрабатывают ультразвуком. Вирус вновь центрифугируют 2 ч при 150 000 g в 20-60% -ном градиенте концентрации сахарозы.

7. Вирус концентрируют повторным центрифугированием 90 мин при 65000 g.

Данная методика позволяет получить частично очищенные препараты радиоактивно меченного РСВ. Для последующей очистки предложены более сложные методы; инфекционность, которая в обычных условиях очень чувствительна к центрифугированию, можно стабилизировать добавлением MgS04 до концентрации 1 М.


Это интересно:

Росолист
Росолист (Dr osophyllum lusitanicum L.) — одно из наиболее замечательных насекомоядных растений, произрастающее в Португалии и в Марокко. Растение отличается от других насекомоядных (Drosera, Pinguicula) как своей внешностью, так в особен ...

Определение содержания МДА в плазме крови и печени
За основу взят классический метод Mihara et al. [30]. 0,4 мл плазмы крови смешивают с 4 мл охлажденной 1,4% ортофосфорной кислоты и 2 мл 0,5% тиобарбитуровой кислоты. Смесь инкубируют в кипящей бане 45 мин после чего охлаждают и добавляют ...

Некоторые симпортеры, антипортеры и унипортеры
К настоящему времени достаточно хорошо охарактеризовано несколько систем, катализирующих транспорт одного или более растворимых веществ. При этом скорость переноса с помощью этих белковых комплексов гораздо ниже, чем даже через наиболее & ...