Градиентное центрифугирование

Материалы » Группа пневмовирусов » Градиентное центрифугирование

В литературе можно встретить не одну методику очистки РСВ градиентным центрифугированием. Представленная ниже была успешно использована для очистки штамма А2.

1. Монослой клеток Нер-2 заражают РСВ. Адсорбцию проводят 2 ч при 37°С, затем добавляют культуральную среду.

2. Через 10 ч после заражения добавляют актиномицин D до концентрации 0,3 мкг/мл. Для радиоактивного мечения РНК через 16-20 ч после заражения заменяют культуральную среду на свежую, содержащую 20 мкКи/мл - уридина. Для введения метки в белки в среду добавляют 5 мкКи/мл - метионина.

3. При проявлении ЦПД и образовании синцитиев собирают культуральную жидкость. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием 20 мин при 11000 g и концентрируют вирус центрифугированием 90 мин при 65000 g на холоду.

4. Осадок ресуспендируют в буфере NTE при ультразвуковой обработке.

5. Вирус центрифугируют 1 ч при 150 000 g в 10-50% -ном градиенте концентрации сахарозы и собирают фракции, содержащие видимую зону вируса.

6. Содержащие вирус фракции объединяют, разводят NTE и обрабатывают ультразвуком. Вирус вновь центрифугируют 2 ч при 150 000 g в 20-60% -ном градиенте концентрации сахарозы.

7. Вирус концентрируют повторным центрифугированием 90 мин при 65000 g.

Данная методика позволяет получить частично очищенные препараты радиоактивно меченного РСВ. Для последующей очистки предложены более сложные методы; инфекционность, которая в обычных условиях очень чувствительна к центрифугированию, можно стабилизировать добавлением MgS04 до концентрации 1 М.


Это интересно:

Вулканическая деятельность на планете. Виды вулканизма
Вулканы – геологические образования, возникающие под каналами и трещинами в земной коре, по которым извергаются на земную поверхность из глубинных магматических источников лавы, горячие газы и обломки горных пород. Обычно вулканы предста ...

Организация мегамира и микромира
Микромир – это мир атомов и элементарных частиц. Наряду с углублением познания в область микромира для науки XX века характерно стремление к изучению объектов мегамира – галактик, Вселенной. Мегамир – мир наиболее знакомых нам объектов « ...

Реакции отжига и расщепления
Первоначально реакцию гибридизации между меченым РНК-зондом и небольшим количеством комплементарных последовательностей из нескольких микрограмм суммарной геномной ДНК проводили с молярным избытком РНК – Сейчас, когда за счет амплификации ...