Анализ вирусных РНК и белков методом электрофореза в полиакриламидном геле. Анализ белков
Синтезированные in vivo или in vitro меченые белки можно анализировать с помощью электрофореза в 10% -ном или б - 15% -ном градиентном полиакриламидном геле, как описано Марсденом и др. .
После электрофоретического разделения в полиакриламидном геле белки можно перенести на нитроцеллюлозный фильтр для биохимического или иммунологического анализа. Применение этого метода к белкам РСВ описано Хиерхольцером и др. Перенос белков из. полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу осуществляется электрофоретически по нижеследующей методике.
1. После электрофоретического разделения белков полиак-риламидный гель помещают в камеру прибора для электрофоретического переноса вместе с листом нитроцеллюлозы. В камеру заливают буферный раствор, содержащий 0,025 М трис, 0, 193 М глицин и 20% метанола, рН 8,35.
2. Для переноса проводят электрофорез при 60 В по крайней мере 4 ч при 4°С.
3. Лист нитроцеллюлозы разрезают на полоски и помещают каждую в закрытую пробирку.
4. Полоски инкубируют с анти-РСВ сывороткой 2 ч при комнатной температуре.
5. Полоски 3 раза промывают PBS, содержащим твин 80.
6. Полоски инкубируют с конъюгатом, разведенным в 1000 раз, 3 ч при комнатной температуре.
7. Полоски 3 раза промывают тем же раствором.
8. Нитроцеллюлозу проявляют раствором, содержащим 50 мг 3,3'-диаминобензидина и 100 мкл 3% -ной перекиси водорода в 100 мл PBS, рН 7,2.
9. Нитроцеллюлозу промывают водой и сушат на листе фильтровальной бумаги.
10. Количественный анализ можно провести спектрофотометрически после обработки нитроцеллюлозы веществами, растворяющими пластмассы. В результате подобной обработки нитроцеллюлоза становится прозрачной.
Это интересно:
История планеты Земля
Земля и другие планеты солнечной системы сформировались 4,54 млрд. лет назад из протопланетарного диска пыли и газа, оставшегося после формирования Солнца. Луна сформировалась позднее, вероятно, в результате касательного столкновения Земл ...
Основы целостного учения Вернадского о биосфере
Российский ученый геобиохимик В.И. Вернадский в 1930-е годы, изучив роль живой материи, прослеживающейся на всем протяжении ее эволюции, пришел к выводу о неразрывной связи живых и неживых систем. В истории Земли происходил непрерывный пр ...
Самое интересное из веществ во всем органическом мире
Так назвал хлорофилл великий Чарльз Дарвин, когда наш соотечественник Климент Аркадьевич Тимирязев рассказал ему о своих опытах с этим веществом. В то время, когда химическая природа процесса фотосинтеза представлялась весьма туманной, по ...