Анализ вирусных РНК и белков методом электрофореза в полиакриламидном геле. Анализ белков

Материалы » Группа пневмовирусов » Анализ вирусных РНК и белков методом электрофореза в полиакриламидном геле. Анализ белков

Синтезированные in vivo или in vitro меченые белки можно анализировать с помощью электрофореза в 10% -ном или б - 15% -ном градиентном полиакриламидном геле, как описано Марсденом и др. .

После электрофоретического разделения в полиакриламидном геле белки можно перенести на нитроцеллюлозный фильтр для биохимического или иммунологического анализа. Применение этого метода к белкам РСВ описано Хиерхольцером и др. Перенос белков из. полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу осуществляется электрофоретически по нижеследующей методике.

1. После электрофоретического разделения белков полиак-риламидный гель помещают в камеру прибора для электрофоретического переноса вместе с листом нитроцеллюлозы. В камеру заливают буферный раствор, содержащий 0,025 М трис, 0, 193 М глицин и 20% метанола, рН 8,35.

2. Для переноса проводят электрофорез при 60 В по крайней мере 4 ч при 4°С.

3. Лист нитроцеллюлозы разрезают на полоски и помещают каждую в закрытую пробирку.

4. Полоски инкубируют с анти-РСВ сывороткой 2 ч при комнатной температуре.

5. Полоски 3 раза промывают PBS, содержащим твин 80.

6. Полоски инкубируют с конъюгатом, разведенным в 1000 раз, 3 ч при комнатной температуре.

7. Полоски 3 раза промывают тем же раствором.

8. Нитроцеллюлозу проявляют раствором, содержащим 50 мг 3,3'-диаминобензидина и 100 мкл 3% -ной перекиси водорода в 100 мл PBS, рН 7,2.

9. Нитроцеллюлозу промывают водой и сушат на листе фильтровальной бумаги.

10. Количественный анализ можно провести спектрофотометрически после обработки нитроцеллюлозы веществами, растворяющими пластмассы. В результате подобной обработки нитроцеллюлоза становится прозрачной.


Это интересно:

Эволюционная теория естественного отбора Ч. Дарвина
Чарльз Дарвин в своем основном труде "Происхождение видов путем естественного отбора" (1859) обобщил эмпирический материал современной ему биологии и селекционной практики, на основе результатов собственных наблюдений во время п ...

Цитопатогенное действие
Характерное для РСВ цитопатогенное действие - это образование синцития. В синцитиях ядра клеток часто образуют агрегаты, окружающие центральную полость. Однако формирование синцития наблюдается далеко не всегда; характер ЦПД определяется ...

Генетика вирусов
Патогенные для человека вирусы обладают двумя основными свойствами - наследственностью и изменчивостью. Модификации у многих вирусов проявляются изменением химического состава внешней оболочки вириона, связанного с включением в его соста ...