Выделение температурно-чувствительных мутантов
Для анализа функций генов и биохимических исследований полезно иметь температурно-чувствительные мутанты вируса. Их выделяют следующим образом.
1.106 клеток BS-C-1, выращенных в чашке Петри диаметром 50 мм или во флаконе с завинчивающейся крышкой емкостью 30 мл, заражают РСВ дикого типа с множественностью инфекции 0,01 БОЕ/кл. Адсорбцию проводят 1 ч при 31 °С.
2. Вирус отмывают двумя сменами среды и добавляют 3 мл среды Игла, содержащей 2,5% ЭТС и мутаген.
3. Культуру инкубируют при 31 °С до проявления ЦПД в контрольной зараженной культуре, к которой мутаген не добавляли.
4. Разведения культуральной жидкости из обработанных мутагеном культур титруют методом бляшек после осветления, но без замораживания и оттаивания. Для этого на клетки наносят необходимые разведения и инкубируют клетки, под 0,9% -ным агаровым покрытием 5-7 сут при 31 °С.
5. Вирус из полученных индивидуальных бляшек наращивают, перенося бляшки пастеровской пипеткой на свежие монослойные культуры.
6. Проводят скрининг полученных изолятов вируса на способность давать бляшки при 31 и 39 °С. Для этого зараженные чашки инкубируют параллельно при каждой температуре. Альтернативный метод состоит в прямом скрининге бляшек, образованных вирусом, обработанным мутагеном. Для этого 2 чашки с культурой, покрытой слоем 0,9% -ного агара толщиной 2 мм, делят на секторы и в каждый сектор помещают 1 бляшку., После адсорбции в течение 30 мин при 31 °С заливают второй слой агарового покрытия. После этого одну чашку инкубируют при 31 °С, а другую при 39 °С. Из секторов, где бляшки образуются при 31 °С, но не при 39 °С, их извлекают для дополнительной проверки.
Температурно-чувствительные мутанты можно подразделить на функциональные группы с помощью теста комплементации, факторы, влияющие на комплементацию, детально изучены.
Как и для остальных вирусов с негативной полярностью РНК и несегментированным геномом, рекомбинация между температурно-чувствительными мутантами РСВ, принадлежащими к одной или к разным группам комплементации, не описана.
Это интересно:
Зеленая электростанция
Существует еще один путь использования человеком солнечной энергии, усвоенной растениями, – непосредственная трансформация световой энергии в электрическую.
Выше мы проследили путь возбужденного квантом света электрона в ходе фотосинтеза ...
Динозавры
Около 210 миллионов лет назад на планете появились псевдозухии, небольшие ящеры, передвигавшиеся на двух ногах; они были вооружены зубами, сидевшими в отдельных ячейках на челюстях, и украшены несколькими рядами костных пластинок, тянувши ...
Сравнить строение пищеварительной, выделительной и нервной
систем у круглых, кольчатых червей и членистоногих. Выделить ароморфозы
кольчатых червей и членистоногих
Сравнение строения систем организма у трех типов животных.
Система организма
Тип животных
Круглые черви
Кольчатые черви
Членистоногие
Пищеварительная
Отделы: передний, средний и задний.
Начинается ротовым и зака ...