Выделение температурно-чувствительных мутантов

Материалы » Группа пневмовирусов » Выделение температурно-чувствительных мутантов

Для анализа функций генов и биохимических исследований полезно иметь температурно-чувствительные мутанты вируса. Их выделяют следующим образом.

1.106 клеток BS-C-1, выращенных в чашке Петри диаметром 50 мм или во флаконе с завинчивающейся крышкой емкостью 30 мл, заражают РСВ дикого типа с множественностью инфекции 0,01 БОЕ/кл. Адсорбцию проводят 1 ч при 31 °С.

2. Вирус отмывают двумя сменами среды и добавляют 3 мл среды Игла, содержащей 2,5% ЭТС и мутаген.

3. Культуру инкубируют при 31 °С до проявления ЦПД в контрольной зараженной культуре, к которой мутаген не добавляли.

4. Разведения культуральной жидкости из обработанных мутагеном культур титруют методом бляшек после осветления, но без замораживания и оттаивания. Для этого на клетки наносят необходимые разведения и инкубируют клетки, под 0,9% -ным агаровым покрытием 5-7 сут при 31 °С.

5. Вирус из полученных индивидуальных бляшек наращивают, перенося бляшки пастеровской пипеткой на свежие монослойные культуры.

6. Проводят скрининг полученных изолятов вируса на способность давать бляшки при 31 и 39 °С. Для этого зараженные чашки инкубируют параллельно при каждой температуре. Альтернативный метод состоит в прямом скрининге бляшек, образованных вирусом, обработанным мутагеном. Для этого 2 чашки с культурой, покрытой слоем 0,9% -ного агара толщиной 2 мм, делят на секторы и в каждый сектор помещают 1 бляшку., После адсорбции в течение 30 мин при 31 °С заливают второй слой агарового покрытия. После этого одну чашку инкубируют при 31 °С, а другую при 39 °С. Из секторов, где бляшки образуются при 31 °С, но не при 39 °С, их извлекают для дополнительной проверки.

Температурно-чувствительные мутанты можно подразделить на функциональные группы с помощью теста комплементации, факторы, влияющие на комплементацию, детально изучены.

Как и для остальных вирусов с негативной полярностью РНК и несегментированным геномом, рекомбинация между температурно-чувствительными мутантами РСВ, принадлежащими к одной или к разным группам комплементации, не описана.


Это интересно:

Отряд Приматы. Лори
Распространены в Индии, на Цейлоне, в Юго-Восточной Азии и Африке к югу от Сахары. Обитатели тропических лесов, обычно густых, влажных или сухих. Размеры небольшие. Длина тела лори 11-39 см. Хвоста нет или он составляет примерно треть, п ...

Статистическая обработка результатов исследования
Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента. Корреляционный анализ проводили с помощью программы Статистика (версия 6.0). ...

Экологические группы птиц
Основные экологические группы птиц. То или иное местообитание населяют птицы разных отрядов. В связи с приспособлением к жизни в сходных условиях у них развились сходные особенности строения и поведения, сформировались экологические групп ...