Электрофорез в ПАГГ применяется для разделения белков по молекулярной массе под действием электрического тока. В качестве стандартного образца используют белки-маркеры с молекулярными массами 11-170 кДа.

Для разделения исследуемых белков использовался 10% разделяющий (нижний) гель (2,5 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,875 мл 4хTris/Cl/SDS pH=8,8; 3,125 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) и 3,9% концентрирующий (верхний) гель (0,65 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,25 мл 4хTris/Cl/SDS pH=6,8; 3,05 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) .

Подготовка проб к электрофорезу осуществлялась следующим образом: к аликвоте супернатанта объёмом 100 мкл добавляли 20 мкл Sample buffer, кипятили 5 мин при 100°С и охлаждали до комнатной температуры. Затем пробы центрифугировали 5 мин при 13000 g и комнатной температуре и отбирали супернатант, который перед нанесением на гель разводили таким образом, чтобы конечная концентрация белка в нём составляла 60 мкг на лунку геля.

Электрофоретическое разделение исследуемых белков проводилось в денатурирующих условиях (использовался 1х Running buffer, содержащий 1% додецилсульфата натрия (Tris, глицин, SDS)) 1-1,5ч при 200 V. Перенос белков с геля на мембрану PVDF осуществлялся в Transfer buffer (Tris, глицин,этиловый спирт) 45-60 мин при 150 mА,110 V.

Это интересно:

Витамин B1
Витамин B1 (тиамин, коэнзим кокарбоксилазы, аневрин). Хорошо растворяется в воде, при кулинарной обработке потери его невелики, но в щелочной среде (при добавлении соды) сильно разрушается; про запас в организме почти не накапливается. Су ...

Определение
Итак, что же такое ноосфера? Термин «ноосфера» применяют представители самых разных профессий: ученые, производственники и политики, авторы популярных изданий и люди, весьма далекие от науки. При этом единого толкования этого понятия не с ...

Диалектика
[От греч. dialektiké (téchnе) — искусство вести беседу, спор, от dialégomai — веду беседу, спор], учение о наиболее общих закономерностях становления, развития, внутренний источник которых усматривается в единстве и б ...