Электрофорез в ПАГГ применяется для разделения белков по молекулярной массе под действием электрического тока. В качестве стандартного образца используют белки-маркеры с молекулярными массами 11-170 кДа.

Для разделения исследуемых белков использовался 10% разделяющий (нижний) гель (2,5 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,875 мл 4хTris/Cl/SDS pH=8,8; 3,125 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) и 3,9% концентрирующий (верхний) гель (0,65 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,25 мл 4хTris/Cl/SDS pH=6,8; 3,05 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) .

Подготовка проб к электрофорезу осуществлялась следующим образом: к аликвоте супернатанта объёмом 100 мкл добавляли 20 мкл Sample buffer, кипятили 5 мин при 100°С и охлаждали до комнатной температуры. Затем пробы центрифугировали 5 мин при 13000 g и комнатной температуре и отбирали супернатант, который перед нанесением на гель разводили таким образом, чтобы конечная концентрация белка в нём составляла 60 мкг на лунку геля.

Электрофоретическое разделение исследуемых белков проводилось в денатурирующих условиях (использовался 1х Running buffer, содержащий 1% додецилсульфата натрия (Tris, глицин, SDS)) 1-1,5ч при 200 V. Перенос белков с геля на мембрану PVDF осуществлялся в Transfer buffer (Tris, глицин,этиловый спирт) 45-60 мин при 150 mА,110 V.

Это интересно:

Функциональные слои ЛКТ
Почему в ЛКТ на каждый глаз приходится больше одного слоя? Сейчас обнаружено, что нейроны в разных слоях имеют различные функциональные свойства. Например, клетки, находящиеся в четвертых дорзальных мелкоклеточных слоях ЛКТ обезьяны, подо ...

Ухо и его функция. Слуховое восприятие
С помощью слуха человек воспринимает звуки. Органом слуха является ухо, которое представляет собой систему последовательно связанных между собой отделов: наружное, среднее и внутреннее ухо. Наружное ухо состоит из ушной раковины и слухов ...

Суточные ритмы органов и тканей
На сегодняшний день установлено, что именно супрахиазматическое ядро посылает сигналы в центры мозга, ответственные за циклическую выработку гормонов-регуляторов суточной активности организма. Одним из таких регуляторных центров служит па ...