Электрофорез в ПАГГ применяется для разделения белков по молекулярной массе под действием электрического тока. В качестве стандартного образца используют белки-маркеры с молекулярными массами 11-170 кДа.

Для разделения исследуемых белков использовался 10% разделяющий (нижний) гель (2,5 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,875 мл 4хTris/Cl/SDS pH=8,8; 3,125 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) и 3,9% концентрирующий (верхний) гель (0,65 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,25 мл 4хTris/Cl/SDS pH=6,8; 3,05 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) .

Подготовка проб к электрофорезу осуществлялась следующим образом: к аликвоте супернатанта объёмом 100 мкл добавляли 20 мкл Sample buffer, кипятили 5 мин при 100°С и охлаждали до комнатной температуры. Затем пробы центрифугировали 5 мин при 13000 g и комнатной температуре и отбирали супернатант, который перед нанесением на гель разводили таким образом, чтобы конечная концентрация белка в нём составляла 60 мкг на лунку геля.

Электрофоретическое разделение исследуемых белков проводилось в денатурирующих условиях (использовался 1х Running buffer, содержащий 1% додецилсульфата натрия (Tris, глицин, SDS)) 1-1,5ч при 200 V. Перенос белков с геля на мембрану PVDF осуществлялся в Transfer buffer (Tris, глицин,этиловый спирт) 45-60 мин при 150 mА,110 V.

Это интересно:

Список сокращенных названий
АСТ – аспартатаминотрансфераза АЛТ – аланиаминотрансфераза ПДК – предельно допустимая концентрация ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения ПОЛ – перекисное окисление липидов АМ – альвеолярные макрофаги ПНЛ – полиморфонукл ...

«Лес, точно терем расписной, лиловый, золотой, багряный»
Изменение окраски листьев – одна из первых примет осени. Много ярких красок в осеннем лесу! Березы, ясени и липы желтеют, розовеют листья бересклета, пунцово-красными становятся узорные листья рябины, оранжевыми и багряными листья осин. Ч ...

Взаимосвязь человеческого мира с окружающей его средой.
Окружающая среда - это все, что окружает человека и прямо или косвенно влияет на его состояние и функционирование (развитие, рост, выживаемость и др.) Окружающая среда включает в себя природную среду, возникшую на Земле вне зависимости от ...