Электрофорез в полиакриламидном геле. Вестерн-блот

Электрофорез в ПАГГ применяется для разделения белков по молекулярной массе под действием электрического тока. В качестве стандартного образца используют белки-маркеры с молекулярными массами 11-170 кДа.

Для разделения исследуемых белков использовался 10% разделяющий (нижний) гель (2,5 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,875 мл 4хTris/Cl/SDS pH=8,8; 3,125 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) и 3,9% концентрирующий (верхний) гель (0,65 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,25 мл 4хTris/Cl/SDS pH=6,8; 3,05 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) .

Подготовка проб к электрофорезу осуществлялась следующим образом: к аликвоте супернатанта объёмом 100 мкл добавляли 20 мкл Sample buffer, кипятили 5 мин при 100°С и охлаждали до комнатной температуры. Затем пробы центрифугировали 5 мин при 13000 g и комнатной температуре и отбирали супернатант, который перед нанесением на гель разводили таким образом, чтобы конечная концентрация белка в нём составляла 60 мкг на лунку геля.

Электрофоретическое разделение исследуемых белков проводилось в денатурирующих условиях (использовался 1х Running buffer, содержащий 1% додецилсульфата натрия (Tris, глицин, SDS)) 1-1,5ч при 200 V. Перенос белков с геля на мембрану PVDF осуществлялся в Transfer buffer (Tris, глицин,этиловый спирт) 45-60 мин при 150 mА,110 V.


Это интересно:

Отдел сине-зеленые водоросли – Cyanophyta
К данному отделу относят одноклеточные, колониальные и нитчатые водоросли, различно окрашенные в зависимости от соотношения пигментов, представленных кроме хлорофилла а и каротиноидов еще синими пигментами – фикоцианином и аллофикоцианино ...

Болезни и вредители шампинона в культуре
Вредный организм или название болезни Симптомы, вредное воздействие Причины и условия распространения НАСЕКОМЫЕ-ВРЕДИТЕЛИ Грибные комарики Sciaridae Повреждение личинками мицелия и плодовых тел. Взрослые летающие нас ...

Черное море и его обитатели
Черное море по составу и характеру распределения живых организмов очень своеобразно и неповторимо. Ни одно море на Земле не имеет разделения по глубине на две зоны - кислородную (до глубины 150-200 м) и лишенную жизни сероводородную (ниже ...