Электрофорез в полиакриламидном геле. Вестерн-блот

Электрофорез в ПАГГ применяется для разделения белков по молекулярной массе под действием электрического тока. В качестве стандартного образца используют белки-маркеры с молекулярными массами 11-170 кДа.

Для разделения исследуемых белков использовался 10% разделяющий (нижний) гель (2,5 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,875 мл 4хTris/Cl/SDS pH=8,8; 3,125 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) и 3,9% концентрирующий (верхний) гель (0,65 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,25 мл 4хTris/Cl/SDS pH=6,8; 3,05 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) .

Подготовка проб к электрофорезу осуществлялась следующим образом: к аликвоте супернатанта объёмом 100 мкл добавляли 20 мкл Sample buffer, кипятили 5 мин при 100°С и охлаждали до комнатной температуры. Затем пробы центрифугировали 5 мин при 13000 g и комнатной температуре и отбирали супернатант, который перед нанесением на гель разводили таким образом, чтобы конечная концентрация белка в нём составляла 60 мкг на лунку геля.

Электрофоретическое разделение исследуемых белков проводилось в денатурирующих условиях (использовался 1х Running buffer, содержащий 1% додецилсульфата натрия (Tris, глицин, SDS)) 1-1,5ч при 200 V. Перенос белков с геля на мембрану PVDF осуществлялся в Transfer buffer (Tris, глицин,этиловый спирт) 45-60 мин при 150 mА,110 V.


Это интересно:

Электрические токи и эмбриональное развитие
Возможно, роль электрических токов в эмбриональном развитии более велика, чем предполагалось. В слоях эпителия у куриных зародышей вследствие работы натриевого насоса создается положительный потенциал, вызывающий трансэпителиальные электр ...

Демонстрационное моделирование
Большой интерес представляет для понимания зарождения человеческих форм общения описанное Фабри «демонстрационное манипулирование» у обезьян. У ряда млекопитающих описаны случаи, когда одни животные наблюдают за манипуляционными действия ...

Определение ХС-ЛНП (холестерина липопротеидов низкой плотности) расчетным методом
Зная уровень ХСобщ плазмы, ХС-ЛВП и ХС-ЛОНП, нетрудно определить содержание ХС-ЛНП по формуле [12]: ХС-ЛНП = ХС - (ХС-ЛВП + ХС-ЛОНП) ...