Электрофорез в ПАГГ применяется для разделения белков по молекулярной массе под действием электрического тока. В качестве стандартного образца используют белки-маркеры с молекулярными массами 11-170 кДа.

Для разделения исследуемых белков использовался 10% разделяющий (нижний) гель (2,5 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,875 мл 4хTris/Cl/SDS pH=8,8; 3,125 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) и 3,9% концентрирующий (верхний) гель (0,65 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,25 мл 4хTris/Cl/SDS pH=6,8; 3,05 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) .

Подготовка проб к электрофорезу осуществлялась следующим образом: к аликвоте супернатанта объёмом 100 мкл добавляли 20 мкл Sample buffer, кипятили 5 мин при 100°С и охлаждали до комнатной температуры. Затем пробы центрифугировали 5 мин при 13000 g и комнатной температуре и отбирали супернатант, который перед нанесением на гель разводили таким образом, чтобы конечная концентрация белка в нём составляла 60 мкг на лунку геля.

Электрофоретическое разделение исследуемых белков проводилось в денатурирующих условиях (использовался 1х Running buffer, содержащий 1% додецилсульфата натрия (Tris, глицин, SDS)) 1-1,5ч при 200 V. Перенос белков с геля на мембрану PVDF осуществлялся в Transfer buffer (Tris, глицин,этиловый спирт) 45-60 мин при 150 mА,110 V.

Это интересно:

Образ жизни ласки
Это один из наиболее специализированных хищников: почти весь ее рацион состоит из мелких мышевидных грызунов, поэтому она придерживается мест, наиболее богатых ими. В средней полосе она ловит в основном полевок и мышей, в степной зоне к н ...

Общая характеристика семейства Розоцветные
Растения весьма разнообразных жизненных форм – вечнозелёные и листопадные деревья, кустарники, полукустарники, многолетние и однолетние травы. Листья очередные или, очень редко, супротивные, простые или сложные, снабжённые прилистниками, ...

Класс многощетинковые кольчецы (polychaeta)
Полихеты названы так потому, что параподии у них включают пучки многочисленных щетинок. Всего насчитывается 6 тыс. полихет. Полихеты – типичные морские животные и очень редко встречаются в пресной воде. Распространение и среда обитания. ...