Электрофорез в ПАГГ применяется для разделения белков по молекулярной массе под действием электрического тока. В качестве стандартного образца используют белки-маркеры с молекулярными массами 11-170 кДа.

Для разделения исследуемых белков использовался 10% разделяющий (нижний) гель (2,5 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,875 мл 4хTris/Cl/SDS pH=8,8; 3,125 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) и 3,9% концентрирующий (верхний) гель (0,65 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,25 мл 4хTris/Cl/SDS pH=6,8; 3,05 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) .

Подготовка проб к электрофорезу осуществлялась следующим образом: к аликвоте супернатанта объёмом 100 мкл добавляли 20 мкл Sample buffer, кипятили 5 мин при 100°С и охлаждали до комнатной температуры. Затем пробы центрифугировали 5 мин при 13000 g и комнатной температуре и отбирали супернатант, который перед нанесением на гель разводили таким образом, чтобы конечная концентрация белка в нём составляла 60 мкг на лунку геля.

Электрофоретическое разделение исследуемых белков проводилось в денатурирующих условиях (использовался 1х Running buffer, содержащий 1% додецилсульфата натрия (Tris, глицин, SDS)) 1-1,5ч при 200 V. Перенос белков с геля на мембрану PVDF осуществлялся в Transfer buffer (Tris, глицин,этиловый спирт) 45-60 мин при 150 mА,110 V.

Это интересно:

Другие функции почек
Регуляция кислотно-щелочного равновесия. Почки участвуют наряду с легкими в регуляции КЩР (кислотно-щелочного равновесия). Прежде всего это осуществляется за счет регуляции процесса реабсорбции бикарбоната натрия, составной части бикарбон ...

Гипотезы о географии возникновения Homo sapiens
Обычно появление Homo sapiens в Европе связывают с афро-азиатскими миграциями. На возможность миграции древних африканских гоминид в Азию, а затем в Европу указывает сходство зубной системы африканских находок, синантропа и предшественник ...

Статистическая обработка результатов
Статистический анализ осуществлялся с помощью программы Statistica 7 с использованием t-критерия Стьюдента. Различие считалось достоверным при уровне значимости Р<0,05. Все исследования выполнены в лаборатории функциональной биохимии ...