Электрофорез в полиакриламидном геле. Вестерн-блот
Электрофорез в ПАГГ применяется для разделения белков по молекулярной массе под действием электрического тока. В качестве стандартного образца используют белки-маркеры с молекулярными массами 11-170 кДа.
Для разделения исследуемых белков использовался 10% разделяющий (нижний) гель (2,5 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,875 мл 4хTris/Cl/SDS pH=8,8; 3,125 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) и 3,9% концентрирующий (верхний) гель (0,65 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,25 мл 4хTris/Cl/SDS pH=6,8; 3,05 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) .
Подготовка проб к электрофорезу осуществлялась следующим образом: к аликвоте супернатанта объёмом 100 мкл добавляли 20 мкл Sample buffer, кипятили 5 мин при 100°С и охлаждали до комнатной температуры. Затем пробы центрифугировали 5 мин при 13000 g и комнатной температуре и отбирали супернатант, который перед нанесением на гель разводили таким образом, чтобы конечная концентрация белка в нём составляла 60 мкг на лунку геля.
Электрофоретическое разделение исследуемых белков проводилось в денатурирующих условиях (использовался 1х Running buffer, содержащий 1% додецилсульфата натрия (Tris, глицин, SDS)) 1-1,5ч при 200 V. Перенос белков с геля на мембрану PVDF осуществлялся в Transfer buffer (Tris, глицин,этиловый спирт) 45-60 мин при 150 mА,110 V.
Это интересно:
Определение параметров транспорта К+ с помощью К+
-селективного электрода
Ион-селективные электроды позволяют определять концентрацию ионов в растворе, которая зависит от разности потенциалов, возникающей между электродом и электродом сравнения.
Среда для К+ - электрода (рН 7.2-7.4): Сахароза 150 мМ; Трис(гидр ...
Пищеварительная система. Дыхательная система. Мочеполовая система.
Общая характеристика органов пищеварительной системы и её функциональное значение. Пищеварительный канал, пищеварительные железы.
Полость рта. Преддверие рта: ротовая щель, стенки преддверие рта. Зубы. Молочные и постоянные зубы, их стро ...
Ишемический инсульт и нейрогенез
Ишемический инсульт (инфаркт мозга) развивается при значительном уменьшении мозгового кровотока. На стадии реперфузии, когда мозговой кровоток восстанавливается, происходит интенсификация окислительного стресса, который характеризуется ка ...