Приготовление образцов ДНК
Страница 1

Препараты ДНК с очень большой молекулярной массой невозможно получить, используя традиционные методы растворения, поскольку такие молекулы очень чувствительны к сдвиговым усилиям. В основе их – огромное осевое отношение молекул ДНК. Например, человеческая хромосома 21-самая маленькая в геноме. Ее ДНК насчитывает 50х10 п. н.и представляет собой единственную молекулу длиной 15 мм. Между тем диаметр этой молекулы всего 20 нм. Таким образом, осевое отношение составляет 10.

Для предотвращения разрушительного воздействия сдвиговых сил процедуру экстракции ДНК из клеток проводят в присутствии агарозы. Этот прием достаточно прост, и получаемые таким способом образцы можно затем использовать в традиционных электрофоретических опытах и экспериментах по клонированию. Живые клетки суспендируют в расплавленной низкоплавкой агарозе. Затем агарозе дают застыть в формочках объемом 100 мкл для формирования блоков, называемых вставками. Формочки можно приобрести у фирмы Pharma-cia-LKB или сделать самим, соединив вместе «хвост к голове» обычные гребенки для электрофореза нужных размеров. Все манипуляции с формочками следует проводить так, чтобы предотвратить их загрязнение нуклеазами. Перед употреблением формочки необходимо тщательно промыть дистиллированной водой и вытереть, одев перчатки. Затем одна сторона формочки заклеивается лентой, используемой в качестве донышка.

В качестве альтернативы агарозным блоквставкам могут выступить агарозные гранулы. Для их получения клеточную суспензию в агарозе по каплям добавляют в масло с одновременным перемешиванием. Размеры гранул контролируются скоростью перемешивания. С образцами ДНК в гранулах можно обращаться так же, как с растворенными. Однако мы предпочитаем использовать агарозные вставки, так как с ними проще работать.

Для выделения ДНК из клеток, лишенных клеточной стенки, поместите заполимеризовавшиеся агарозные вставки в раствор ESP и инкубируйте 2 дня при 50°С. В этом растворе происходит лизис клеток и отделение белков и других молекул от ДНК. Интактную хромосомную ДНК можно анализировать с помощью ПЭФ непосредственно из раствора ESP. Образцы ДНК в растворе ESP хранятся неопределенно долго при +4°С или даже при комнатной температуре прямо в пробирках Эппендорф.

При наличии клеточной стенки ее необходимо удалить перед экстракцией ДНК, поместив клетки в раствор ESP. Методики выделения ДНК из клеток с интактной стенкой представлены в табл. 4–6. Состав клеточной стенки значительно варьирует для различных организмов. В некоторых случаях может оказаться необходимым подбор различных ферментов, расщепляющих полисахариды клеточной стенки. Многие из этих ферментов не требуют для своей работы присутствия двухвалентных катионов. Таким образом, обработка этими ферментами может проводиться в присутствии большого количества ЭДТА для предотвращения деградации хромосомной ДНК-

Все образцы должны быть обязательно проинкубированы в растворе ESP в течение 2 дней при 50°С. Вставки станут прозрачными гораздо раньше окончания инкубации. Однако инкубацию следует продолжить, чтобы добиться полного отделения от ДНК связанных с ней различных молекул. Белки, связанные с ДНК, могут изменять ее электрофоретическую подвижность. Кроме того, образцы, проинкубированные более короткое время, оказываются устойчивыми к воздействию некоторых рестриктаз.

Страницы: 1 2 3


Это интересно:

Биохимические циклы в биосфере (круговороты биогенных элементов)
Земля - конечное физическое тело, и количество любых химических элементов на Земле конечно. Но уже миллионы лет, с тех пор, как появилась жизнь на планете, идет процесс фотосинтеза органического вещества из неорганических компонентов - и ...

Внешний вид и нравы
Морда у гепарда красива и очень своеобразна. От глаз к уголкам рта тянуться две черные полоски, придавая гепарду грустный и даже несчастный вид. Шерсть у гепарда короткая, песчаного оттенка, и вся шкура - кроме светлого брюха - усыпана ме ...

Локализация звука
Чрезвычайная чувствительность и частотная избирательность слуховой системы была представлена у животных задолго до того, как развилась человеческая речь. В значительной степени тонкости слуховой системы возникли, чтобы улучшить способност ...