Наиболее общая проблема, возникающая при использовании описанной ниже техники получения ДНК из новых организмов, – это измерение конечной концентрации ДНК. Надо стремиться к тому, чтобы концентрация ДНК в агарозной блоквставке была «удобна» для нанесения на форезный гель. Такая концентрация должна быть определена эмпирически. Возможное число клеток и количество ДНК предложены в прилагаемых протоколах опытов. Эти цифры можно использовать как предварительные и менять в зависимости от условий куль-

1. 50 хисходный раствор Денхардта

Этот раствор – одни из компонентов смеси для прегибрндизации и гибридизации

На 500 мл раствора:

поливинилпирролидои 5 г, фиколл 5 г, БСА, фракция V 5 г.

Простерилизуйте фильтрацией через одноразовый фильтр и храните в аликвотах по 30 мл при – 20°С.

2. Раствор для лизиса клеток Е. coli

Раствор можно использовать для приготовления сферопластов из различных бактерий

Конечные концентрации На 1 л

6 мМ трис-HCl 6 мл 1 М раствора

1 М NaCl 58,4 г

100 мМ ЭДТА 100 мл 0,5 М раствора

0,5% бридж-58 60 мл 10%-ного раствора

0,2% дезоксихолата 50 мл 4%-ного раствора

0,5% са|ркозила 5 мл 100%-ного раствора

Проавтоклавируйте

Добавьте свежими: 1 мг/мл лизоцима яичного белка 20 мкл/мл бычьей панкреатической РНКазы

3. ESP

Этот раствор используется для выделения любых больших молекул ДНК.

Он имеет еще одно название – NDS.

Конечные концентрации

0,5 М ЭДТА

Автоклавируйте

1% лаурилсаркозин

Тщательно перемешайте до полного растворения 1 мг/мл протеиназы К Инкубируйте 2 ч при 37°С Храните в аликвотах замороженным

Для работы: смешайте с равным объемом образца и инкубируйте 1–2 дня при 50°С.

4. Смесь для прегибрндизации и гибридизации Конечные концентрации На 1 л

3хSSC 100 мл 30 X раствора

0,1% SDS 5 мл 20%-иого раствора

10Х раствор Денхардта 200 мл 50х раствора

10% декстрансульфат> 200 мл 50%-го раствора

ДНК спермы лосося 5 мг/мл

Смесь храните замороженной в аликвотах по 30 мл для прегибридизационного раствора и в аликвотах по 20 мл для гибридизационного раствора.

5. 1ХМ9

На 1 л: 50 г. Na2HPO «

30 г. КН2Р04

5 г NaCl

10 г. NH4C1

Разведите до однократной концентрации и проавтоклавируйте.

После автоклавирования добавьте Конечные концентрации На 1 л

1 мМ MgS04 1 мл 1 М раствора

0,1 М СаС12 0,2 мл 0,5 М раствора

0,4% глюкоза 10 мл 40%-ного раствора

0,5% казаминокислот 25 мл 20%-ного раствора

Необязательные добавки

50 мкл/мл аминокислот 10 мл раствора 5 мг/мл

10 мкг/мл витаминов 10 мл раствора 1 мг/мл

50 мкг/мл оснований 25 мл раствора 2 мг/мл

6. Pett IV

Этот раствор предназначен для отмывки бактериальных клеток перед выделением сферопластов

Конечные концентрации На 1 л

10 мМ трис-HCl 10 мл 1 М раствора

1 М NaCI 58,44 г.

Проавтоклавируйте.

7. 0,1 М ФМСФ Раствор используется для инактивации протеиназы К. Ресуспендируйте 17,5 мг

ФМСФ в

1 мл изопропанола.

Помните, что раствор нестабилен, поэтому его надо использовать свежим и готовить перед употреблением. ФМСФ очень токсичен.

Это интересно:

Биосинтез белков
Любая живая клетка способна синтезировать белки, и эта способность представляет одно из наиболее важных и характерных ее свойств. С особенной энергией идет биосинтез белков в период роста и развития клеток. В это время активно синтезируют ...

Метод определения активности церулоплазмина
Активность церулоплазмина определяли модифицированным методом Ревина, который базируется на окислении p-фенилендиамина при участии этого фермента. Ферментативную реакцию останавливают добавлением фтористого натрия. По оптической плотности ...

Строение млекопитающих
Кожный покров (рис. 1) у млекопитающих имеет более сложное строение, чем у других позвоночных. Сложно и разнообразно и его значение. Вся система кожных покровов играет огромную роль в терморегуляции млекопитающих Шерстный покров, а у водн ...