Определение концентрации ХС-ЛВП (холестерина-липопротеидов высокой плотности) (HDL) в сыворотке и плазме крови
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Хиломикроны, липопротеиды низкой плотности (LDL) и липопротеиды очень низкой плотности (V LDL) осаждаются при добавлении к образцу фосфовольфрамат/Mg²+. После центрифугирования в супернатанте остаются только
HDL, концентрация которых определяется так же как концентрация общего холестерина.
Набор
реагентов
: HDL CHOLESTEROL «FL - E» («Vital-Diagnostics»)
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
1. Преципитация
|
Реагенты |
Опытные пробы, (мл.) |
Калибровочные пробы, (мл.) |
Контрольные пробы, (мл.) |
|
Сыворотка или плазма |
0,15 |
_ |
_ |
|
H2O |
_ |
_ |
0,15 |
|
Осаждающий реагент |
0,3 |
0,3 |
0,3 |
|
Раствор холестерина |
_ |
0,15 |
_ |
Хорошо перемешать и оставить на 10 мин при комнатной температуре. Опытные пробы отцентрифугировать в течение 10 мин при 4000g или 1-2 мин 1000g. Прозрачный супернатант использовать для определения концентрации HDL. Калибровочные и контрольные пробы центрифугировать не нужно. Определение холестерина во всех пробах в течение часа.
2. Определение концентрации HDL
|
Реагенты |
Опытные пробы, (мл.) |
Калибровочные пробы, (мл.) |
Контрольные пробы, (мл.) |
|
Супернатант |
0,2 |
_ |
- |
|
H2O+ реагент №1 |
_ |
_ |
0,2 |
|
Рабочий реагент для определ. холестерина |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
|
Раствор холестерина+реагент №1 |
_ |
0,2 |
_ |
Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют не менее 10 мин при комнатной температуре (20-25°С) или 5 мин при 37°С и измеряют оптическую плотность опытных и калибровочных проб против контрольной пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 см (1 см.) при длине волны 500 нм (ФЭК- 490 нм). Окраска стабильна не менее 2-х часов после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света.
Расчет концентрации (С) холестерина HDL проводят по формуле:
С = Ео/Ест * 1,29 (ммоль/л) или С = Ео/Ест * 50 (мг/100 мл) Ео и Ест – экстинция образца и стандарта, измеряется относительно контрольной пробы.
Это интересно:
Практическое применение знаний о взаимодействии микроорганизмов с высшими
растениями во внеурочной работе
Учащихся необходимо учить пользоваться научными знаниями при выполнении внеурочной работы. Учитель должен давать им задания с использованием биологических знаний при постановке опытов на учебно-опытном участке, при сборе растений для колл ...
Электрофорез в полиакриламидном геле. Вестерн-блот
Электрофорез в ПАГГ применяется для разделения белков по молекулярной массе под действием электрического тока. В качестве стандартного образца используют белки-маркеры с молекулярными массами 11-170 кДа.
Для разделения исследуемых белков ...
Абиогенез
Существовало множество теорий о происхождении жизни на Земле. Часть ученых считала, что жизнь была создана Творцом, другие же полагали, что существуют некие «семена жизни», переносимые с планеты на планету метеоритами - «теория пансперми ...